新一代多功能抗體納米團(tuán)簇的制備及其協(xié)同治療應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是新一代多功能抗體納米團(tuán)簇的制備及其 協(xié)同治療應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子靶向治療是指針對(duì)參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和其他生物學(xué) 途徑的治療手段。廣義的分子靶向治療的靶點(diǎn)包括了參與細(xì)胞分化、凋亡、迀移、侵襲性行 為、淋巴轉(zhuǎn)移、全身轉(zhuǎn)移等多過程的從DNA到蛋白水平的任何亞分子。本世紀(jì)以來，分子靶 向治療已成為腫瘤學(xué)研宄的熱點(diǎn)和主要方向，推動(dòng)著腫瘤治療理念和理論的發(fā)展。利妥昔 單抗（Rituximab，C2B8,商品名美羅華）是第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)的以人⑶20分子為靶點(diǎn)治療 非霍奇金淋巴瘤的單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb)?，F(xiàn)Rituximab+經(jīng)典的CHOP 化療方案（環(huán)磷酰胺+阿霉素+長(zhǎng)春新堿+潑尼松）已經(jīng)成為CD20+非霍奇金淋巴瘤治療 的一線方案，在西方，幾乎所有的CD20+非霍奇金淋巴瘤患者在其病程中都會(huì)接受利妥昔 單抗的治療。隨后，抗體的靶向治療已成為目前抗腫瘤生物治療的主要手段。目前已有十 幾種抗體被FDA批準(zhǔn)用于臨床治療。
[0003] 然而并非所有的患者對(duì)抗體的分子靶向治療都敏感。因此如何解決抗體的殺傷效 果及其臨床上表現(xiàn)出來的耐藥問題成為廣大科研和臨床工作者函待解決的主要問題。傳 統(tǒng)癌癥抗體治療方法雖然已取得了一些可觀的成效，但是徹底治愈和消除癌癥仍然是當(dāng)前 社會(huì)醫(yī)療和人口健康的重大挑戰(zhàn)之一。例如，近年來，雖然NHL對(duì)傳統(tǒng)的放化療較敏感，約 48%的病人對(duì)Rituximab單抗治療產(chǎn)生不良反應(yīng)，其余的患者盡管初次治療效果很好，但 經(jīng)過一段時(shí)間的治療會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，甚至復(fù)發(fā)。研宄表明CD20抗體主要通過補(bǔ)體依賴 的細(xì)胞毒作用（complement dependent cytotoxicity ;□)〇、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞 毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞凋 亡三種機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞。根據(jù)CD20抗體與靶細(xì)胞的CD20結(jié)合后的轉(zhuǎn)脂筏能力將其分為 兩型，I型抗體主要作用機(jī)制包括⑶C、ADCC，而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力很弱。II型抗體 主要作用機(jī)制包括ADCC、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而⑶C作用很弱。此外，I型⑶20抗體在體外 與靶細(xì)胞的CD20結(jié)合后，再經(jīng)過二抗的交聯(lián)，可以誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的凋亡。研宄表明， II型⑶20抗體誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡并不依賴于傳統(tǒng)的Caspase通路，而是依賴一條與溶酶 體相關(guān)的特殊途徑，而I型抗體交聯(lián)后誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞的凋亡依賴于傳統(tǒng)的Caspase通路。 然而，將CD20抗體進(jìn)行交聯(lián)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡在體內(nèi)情況下無法實(shí)現(xiàn)。
[0004] 基于納米技術(shù)的抗腫瘤治療給癌癥患者帶來新的希望，與傳統(tǒng)的抗體藥治療相 比，納米醫(yī)藥載體有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：體內(nèi)較穩(wěn)定，對(duì)正常組織毒副作用低，可以實(shí)現(xiàn)藥物可 控釋放，提高生物利用度。然而，基于傳統(tǒng)納米載藥體系發(fā)展仍然不完善，受到體內(nèi)外很大 因素限制，導(dǎo)致目前納米藥物治療的瓶頸問題：1，納米載體體內(nèi)穩(wěn)定性差、循環(huán)時(shí)間短；2， 由于靶向性和穩(wěn)定性差，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)富集不足；3,腫瘤細(xì)胞靶向性及結(jié)合作用不強(qiáng)導(dǎo)致胞 吞少；4,胞內(nèi)特定部位藥物釋放不可控的問題。
[0005] 納米醫(yī)學(xué)是將現(xiàn)代物理學(xué)、現(xiàn)代化學(xué)和先進(jìn)工程技術(shù)與醫(yī)學(xué)相結(jié)合的一門邊緣學(xué) 科，其由于毒副作用低、治療效果好，在惡性腫瘤的預(yù)防及治療中發(fā)揮著越來越重要的作 用。本發(fā)明把納米技術(shù)與靶向治療抗體相結(jié)合，制備出新型的抗體納米團(tuán)簇，擬為淋巴瘤的 治療提供新的方法和思路。
[0006] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的新型抗體納米團(tuán)簇，國(guó)內(nèi)外尚未見類似的研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供新一代多功能抗體納米團(tuán)簇。
[0008] 本發(fā)明的再一的目的是，提供新一代多功能抗體納米團(tuán)簇的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的另一的目的是，提供新一代多功能抗體納米團(tuán)簇的協(xié)同治療功能。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：抗體納米團(tuán)簇，所述的抗體納米團(tuán)簇 由兩種或兩種以上的同一類型或不同類型的抗體通過鉸鏈偶聯(lián)到同一大分子鏈或球面上， 鏈接抗體和大分子鏈的鉸鏈劑分子包括可氧化還原降解，可水解，可酸解等可斷裂的化學(xué) 鍵，及不可斷裂的化學(xué)鍵。
[0011] 所述的抗體納米團(tuán)簇的形態(tài)為鏈狀、球狀或棒狀，所述的抗體納米團(tuán)簇的尺寸范 圍為0. 05-20 μL?，所述的分子鏈或球面的分子量為5000-100000g/mol。
[0012] 所述的抗體納米團(tuán)簇還包括修飾其表面的PEG分子、溫敏高分子或pH值敏感等功 能高分子，所述的PEG分子的分子量為500-10000g/mol。
[0013] 所述舉例的抗體為抗⑶20抗體。
[0014] 所述的抗體為I型抗⑶20抗體與II型抗⑶20抗體。
[0015] 所述的I型抗⑶20抗體是Rituximab，所述的II型抗⑶20抗體是11B8。
[0016] 所述的抗體納米團(tuán)簇以短鏈聚乙稀亞胺為載體，將I型抗⑶20抗體Rituximab與 II型抗⑶20抗體11B8在體外進(jìn)行交聯(lián)制得。
[0017] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：所述的抗體納米團(tuán)簇的制備 方法包括以下步驟：
[0018] I) PEI溶液與MPEGS溶液反應(yīng)制得MPEGS-PEI溶液，
[0019] 2)分別將Rituximab抗體和11B8抗體疏基化，
[0020] 3)巰基化的Rituximab抗體與巰基化的11B8抗體混合，再與MPEGS-PEI溶液反應(yīng) 制得抗體納米團(tuán)簇。
[0021] 為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：所述的抗體納米團(tuán)簇在制備 治療腫瘤（實(shí)體瘤及血液瘤）藥物中的應(yīng)用。
[0022] 所述的腫瘤為淋巴瘤。
[0023] 本發(fā)明制備的抗CD20抗體納米團(tuán)簇具有如下特點(diǎn)：
[0024] (1)、所述抗體納米團(tuán)簇首次將兩種不同抗體在體外進(jìn)行交聯(lián)并成功應(yīng)用體內(nèi)，解 決了 CD20抗體交聯(lián)在體內(nèi)無法應(yīng)用的科學(xué)難題。
[0025] (2)、所述抗體納米團(tuán)簇在體外實(shí)驗(yàn)中成功激活了目前已知的所有CD20抗體抗腫 瘤作用的四條通路，包括⑶C，ADCC，溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及caspases依賴的細(xì)胞凋亡 通路，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的腫瘤殺傷效果。
[0026] (3)、所述抗體納米團(tuán)簇能夠結(jié)合不同腫瘤細(xì)胞表面的CD20抗原，引起淋巴瘤細(xì) 胞的同源聚集，增強(qiáng)其抗腫瘤作用。
[0027] (4)、所述抗體納米團(tuán)簇與其來源抗體Rituximab、llB8相比具有更長(zhǎng)的半衰期。
[0028] (5)、所述抗體納米團(tuán)簇對(duì)臨床上對(duì)Rituximab耐藥的淋巴瘤細(xì)胞仍然具有較強(qiáng) 的殺傷作用。
[0029] (6)、所述抗體納米團(tuán)簇能通過納米藥物增強(qiáng)的滲透與滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR)以及抗原抗體的識(shí)別和結(jié)合效應(yīng)，增強(qiáng)其在腫 瘤內(nèi)部的富集能力。
【附圖說明】
[0030] 附圖1為抗⑶20抗體納米團(tuán)簇構(gòu)建示意圖。
[0031] 附圖2為抗⑶20抗體納米列針鑒定與表征分析。
[0032] 2A !SDS-PAGE鑒定抗CD20抗體納米團(tuán)簇的成功構(gòu)建。1-2 :PEI，3-4