中藥地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及中藥地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 地榆為薔薇科植物地榆（Sanguisorba officinalis L)或長葉地榆（Sanguisorba officinalis L.var.longifolia(Bert.)Yiiet Li)的干燥根。我國全國各地均有產(chǎn)，主產(chǎn) 于浙江、安徽、山東、湖南、湖北等地。地榆性微寒，味苦、澀、酸，歸肝、胃、大腸經(jīng)，有涼血止 血、解毒斂瘡等功效，臨床常用于便血、濤血、血病、崩漏、水火燙傷、通腫瘡毒等病癥的治療 (參見：清·孫星衍，孫星翼輯.神農(nóng)本草經(jīng)[M].北京：商務(wù)印書館，1955. 94.)。
[0003] 地榆也具備有抗菌消炎的作用，但主要集中于金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌等 細(xì)菌(參見文獻(xiàn)：吳開云，黃雪芳，彭宣憲.冰片、虎杖、地榆抑菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].江 西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1996, 36(2) :53-55.)。地榆主要為生用或炒炭用。生地榆是未經(jīng)炮制的地 榆飲片，常研磨外用治療水火燙傷、濕疹、皮膚潰瘍等疾病，有收斂吸濕的作用。地榆炭是用 炒炭法炮制的地榆飲片，止血作用強(qiáng)，療效勝于生地榆。將生地榆粗提物分別用石油醚、乙 酸乙酯、正丁醇、水萃取后檢測其抗真菌的活性，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取部分的抗菌活性效果最 好。
[0004] 目前尚未見地榆有關(guān)抗真菌的報(bào)道，也未見其作為協(xié)同抗真菌增效藥物的相關(guān)報(bào) 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供中藥地榆的新的醫(yī)藥用途。
[0006] 本發(fā)明提供了中藥地榆作為抗真菌藥物增效藥的新用途，即地榆在制備抗真菌藥 物增效劑中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所述的中藥地榆(地榆)，包括地榆的兩種不同炮制藥材--生地榆和地榆 炭。也包括通過乙酸乙酯萃取等方法提取到的地榆的活性成份。
[0008] 本發(fā)明所述的抗真菌藥物為常規(guī)抗真菌藥物，包括但不限于氟康唑、卡泊芬凈、特 比萘芬、兩性霉素B等。
[0009] 本發(fā)明經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，地榆對氟康唑，咪康唑，卡泊芬凈，兩性霉素B等常規(guī)抗 真菌藥物有增效作用，對于耐藥真菌，抗真菌藥物與地榆合用時(shí)，能明顯降低常規(guī)抗真菌藥 物的藥物劑量，能不同程度地提高常用抗真菌藥對真菌的抑制作用，并能使抗真菌藥物恢 復(fù)對耐藥真菌的作用，增強(qiáng)對耐藥真菌的抑制作用。
[0010] 本發(fā)明為中藥地榆開辟了新的用途，將其用于抗真菌藥物的增效劑，不僅能提高 藥物的抗真菌作用，而且在臨床真菌耐藥性日趨普遍、耐藥程度日趨嚴(yán)重的情況下，使抗真 菌藥物恢復(fù)對耐藥真菌的作用，可降低抗真菌藥物的用藥劑量，為患者節(jié)省了醫(yī)療費(fèi)用，并 可減少藥物的毒副作用。 toon] 本發(fā)明的中藥地榆是我國傳統(tǒng)藥物，具有資源豐富，價(jià)格便宜，副作用小等優(yōu)點(diǎn)， 地榆和抗真菌藥物合用也能夠減少藥物的毒副作用，節(jié)省患者的醫(yī)藥費(fèi)用。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0013] 實(shí)施例1 :生地榆與抗真菌藥聯(lián)用7株念珠菌的作用
[0014] 一、材料和方法
[0015] 1、試劑
[0016] 生地榆：上海雷允上醫(yī)藥有限公司中藥部
[0017] 地榆炭：上海雷允上醫(yī)藥有限公司中藥部
[0018] 氟康唑注射液：輝瑞制藥有限公司
[0019] 無水乙醇：上海國藥集團(tuán)有限公司
[0020] 石油醚：上海國藥集團(tuán)有限公司
[0021] 乙酸乙酯：上海國藥集團(tuán)有限公司
[0022] 正丁醇：上海國藥集團(tuán)有限公司
[0023] 中藥提取液的制備：分別取生地榆，地榆炭中藥粉末各5g，加入70%的乙醇溶液 50ml，于室溫下50KHz超聲40分鐘，冷卻后重復(fù)超聲兩次，3000 X g，離心5min，取上清液，該 藥生藥濃度為0. lg/mL，放于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0024] 生地榆乙酸乙酯萃取液的制備：將保存的中藥粗體物40ml，烘干，加水混懸，分 別依次加入萃取液（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇）1~1. 5倍體積，立即充分震蕩混勻，然后 靜置分液漏斗，待液體分層后，從下端出口接取萃取液，每種萃取液重復(fù)多次萃取至萃取液 無色或顏色變淡。合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸干，取少量用DMSO配置成5. 12mg/mL的溶液。
[0025] 2、菌株
[0026] 菌株：白色念珠菌103 (簡稱103)、白色念珠菌SC5314 (簡稱sc5314)、白色念珠 菌100 (簡稱100)、克柔念珠菌ATCC2159 (簡稱克柔ATCC2159)、熱帶念珠菌ATCC087 (簡 稱熱帶ATCC087)、光滑念珠菌ATCC28226 (簡稱光滑ATCC28226)、近平滑念珠菌22090 (簡 稱近平22090)，均由上海長海醫(yī)院真菌室提供，分別采自長海醫(yī)院不同科室臨床樣本，并經(jīng) 形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定，也可購自中科院細(xì)胞所或ATCC保藏機(jī)構(gòu)等。
[0027] 所有實(shí)驗(yàn)用菌株均于沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA)劃板活化，白色念珠菌于30°C 培養(yǎng)2周后，分別挑取單克隆再次劃板活化，取第二次所得單克隆置SDA斜面，用上述方法 培養(yǎng)后于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0028] 3、培養(yǎng)液
[0029] 沙堡葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（SDA):
[0030] 蛋白胨l〇g，葡萄糖40g，瓊脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶 液50ml，調(diào)整pH至7. 0,以三蒸水定容至1000ml，高壓滅菌（121°C 15min)后于4°C保存?zhèn)?用。
[0031] YEro 培養(yǎng)液：
[0032] 酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/m氯霉素水 溶液50ml，三蒸水定容至1000ml，高壓滅菌（121 °C，15min)后于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0033] RPMI1640液體培養(yǎng)液：
[0034] RPMI1640 (Gibco BRL) 10g，NaHC032. 0g，嗎啡啉丙磺酸（MOPS) (Sigma) 34. 5g (0· 165M)，加三蒸水900ml溶解，IN NaOH調(diào)pH至7. 0(25 °C )，三蒸水定容至1000ml， 0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0035] 4、儀器設(shè)備
[0036] MDF1-100手提式高速中藥粉碎機(jī)(上海市民德機(jī)械制造有限公司）
[0037] DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英略矛華儀器廠）
[0038] SHZ-D (III)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英略矛華儀器廠）
[0039] RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠）
[0040] KQ-C玻璃儀器氣流烘干器(鞏義市英略矛華儀器廠）
[0041] Multiskan MK3型酶標(biāo)檢測儀(芬蘭Labsystems產(chǎn)品）
[0042] 全溫振蕩培養(yǎng)箱(培英，HZQ-F160)
[0043] MJX型智能霉菌培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠）
[0044] SW-CT-IF型單人雙面凈化工作臺（蘇州凈化有限公司）
[0045] 生物顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠XSZ-G)
[0046] 5、菌液制備
[0047] 實(shí)驗(yàn)前，從4°C保存的SDA培養(yǎng)基上挑取念珠菌，接種至Iml YEH)培養(yǎng)液，于30°C， 200rpm振蕩培養(yǎng)，活化兩次后，使真菌處于指數(shù)生長期后期。取該菌液IOul至ImlYEro培 養(yǎng)液中，用上述方法再次活化，16h后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液 濃度至IX IO3~5 X IO3個(gè)/ml。
[0048] 6、藥敏反應(yīng)板的制備
[0049] 取無菌96孔板，于每排1號孔加 RPMI1640液體培養(yǎng)基100 μ 1作空白對照；3~ 12號孔各加新鮮配制的菌液100 μ 1 ;2號孔分別加菌液198 μ 1和受試化合物溶液2 μ 1 ; 12號孔不含藥物，只加菌液100 μ 1作陽性生長對照。2~11號孔進(jìn)行倍比稀釋，使各孔的 最終藥物濃度分別為 1000、500、250、125、62· 5、3L 25、15· 625、7· 8125、3· 906 和 L 953μ g/ ml，各孔中乙醇含量均低于1%。每次配制藥敏板的同時(shí)均制備一質(zhì)控菌藥敏板，各藥敏板 于30 °C恒溫箱培養(yǎng)。
[0050] 7、最低抑菌濃度（MIC值）的判定
[0051] 在30°C恒溫箱中，白念珠菌培養(yǎng)48h，用酶標(biāo)分析儀于630nm測各孔OD值。與陽 性對照孔比，以O(shè)D值下降80%以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC8q (真菌生長80%被 抑制時(shí)的藥物濃度)。
[0052] 當(dāng)藥物的MIC8tl值超過測定濃度范圍時(shí)，按以下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：MIC 8tl值高于最 高濃度1000 μ g/ml時(shí)，計(jì)為">1000 μ g/ml" ；氟康唑MIC8tl值高于最高濃度64μ g/ml 時(shí)，計(jì)為">64 μ g/ml" ；藥物MIC8tl值為最低濃度或在最低濃度以下時(shí)，不作區(qū)別，均計(jì)為 "彡1.953 μ g/ml"；氟康唑MIC8tl值為最低濃度或在最低濃度以下時(shí)，不作區(qū)別，均計(jì)為 "彡0. 125 μ g/ml "。上述實(shí)驗(yàn)均平行操作2到3次，當(dāng)MIC8tl值能準(zhǔn)確重復(fù)或只差一個(gè)濃度 時(shí)才被接受，并以較高濃度作為MIC8tl值；當(dāng)MIC8tl值相差兩個(gè)濃度以上時(shí)，則需重新實(shí)驗(yàn)， 直到符合要求為止。
[0053] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0054] 表1中藥生地榆提取液與氟康唑合用對7株念珠菌的抗真菌作用（生藥濃度）
[0055]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述 的地榆為生地榆或地榆炭。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述 的地榆為地榆通過乙酸乙酯萃取方法提取到的活性成份。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應(yīng)用，其特征在于， 所述的抗真菌藥物為氟康唑、卡泊芬凈、特比萘芬，或兩性霉素B。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及中藥地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，地榆對氟康唑，咪康唑，卡泊芬凈，兩性霉素B等常規(guī)抗真菌藥物有增效作用，對于耐藥真菌，抗真菌藥物與地榆合用時(shí)，能明顯降低常規(guī)抗真菌藥物的藥物劑量，能不同程度地提高常用抗真菌藥對真菌的抑制作用，并能使抗真菌藥物恢復(fù)對耐藥真菌的作用，增強(qiáng)對耐藥真菌的抑制作用。本發(fā)明為中藥地榆開辟了新的用途，在臨床真菌耐藥性日趨普遍、耐藥程度日趨嚴(yán)重的情況下，可降低抗真菌藥物的用藥劑量，為患者節(jié)省了醫(yī)療費(fèi)用，并可減少藥物的毒副作用。
【IPC分類】A61P31-10, A61K45-00, A61K36-739
【公開號】CN104857116
【申請?zhí)枴緾N201410060182
【發(fā)明人】曹永兵, 葉招澆, 姜遠(yuǎn)英, 劉謀志, 閻瀾, 李洪嬌, 王彥, 曹穎瑛, 汪瑞蓮
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2014年2月21日