一種上調(diào)Runx2轉(zhuǎn)錄活性的化合物在防治骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種化合物在防治骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用。具體來說，本發(fā)明涉及所述化合物在制備Runx2表達(dá)活性上調(diào)劑、細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性上調(diào)劑以及抑制多核成熟破骨細(xì)胞形成藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
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[0002]骨質(zhì)疏松是一種以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，容易發(fā)生骨折為特征的全身代謝性骨病。骨質(zhì)疏松可發(fā)生于任何人群和任何年齡，多見于中老年人。骨代謝平衡是由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收兩個動態(tài)過程精妙地調(diào)控的。當(dāng)骨吸收超過骨形成時，會出現(xiàn)骨量減少，可出現(xiàn)骨丟失，發(fā)生骨質(zhì)疏松。
[0003]治療骨質(zhì)疏松的藥物通常分為兩類:抗骨吸收藥物和促進(jìn)骨形成藥物?？构俏账幬锿ㄟ^抑制破骨細(xì)胞的活性從而減少骨吸收。目前可用的抗骨吸收藥物有雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素和雌激素等。對于已經(jīng)患有骨質(zhì)疏松癥或骨量嚴(yán)重丟失的人群，單純抑制骨吸收顯然不夠，促進(jìn)成骨形成已成為治療骨質(zhì)疏松的新型重要策略，此類藥物還能夠直接促進(jìn)骨折并發(fā)癥后的骨再生。目前人源重組甲狀旁腺激素(rhPTH)，是美國FDA唯一批準(zhǔn)上市的促進(jìn)骨形成藥物。其具體作用機(jī)制仍在研宄中，可能是影響多條信號通路，改變成骨細(xì)胞、骨系細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的活性[JilkaRL.Bone, 2007, 40 (6): 1434-1446.]。rhPTH作為當(dāng)前最為有效的促進(jìn)骨形成藥物，也存在著一定的局限性。因此，開發(fā)新型多效的小分子促進(jìn)骨形成藥物，有望在未來的骨質(zhì)疏松治療領(lǐng)域具有廣闊前景。
[0004]成骨細(xì)胞作為主要的骨形成細(xì)胞，來源于具有成骨分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，通過產(chǎn)生堿性磷酸酶(ALP)和骨基質(zhì)蛋白，包括骨鈣素(OCN)和骨橋蛋白(OPN)，誘導(dǎo)礦化的發(fā)生。基于成骨細(xì)胞在骨形成中的重要作用，因而認(rèn)為能增加成骨系細(xì)胞增殖或促進(jìn)成骨分化的化合物具有促進(jìn)骨形成的效應(yīng)。
[0005]近幾年，在小鼠和人身上進(jìn)行的分子遺傳學(xué)研宄進(jìn)展，揭示了參與調(diào)控成骨細(xì)胞發(fā)生的多種轉(zhuǎn)錄因子及其作用。這些轉(zhuǎn)錄因子在成骨細(xì)胞的定向、分化和功能行使等過程中都發(fā)揮了調(diào)控作用，使得相關(guān)細(xì)胞表達(dá)特定的表型基因并獲得成骨細(xì)胞表型。在這些轉(zhuǎn)錄因子中，Runx2 (Runt-related transcript1n factor 2)被證實為調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞定向和分化的主要轉(zhuǎn)錄因子。Runx2屬于Runt結(jié)構(gòu)域基因家族成員，在間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育為骨時開始表達(dá)，之后在成骨細(xì)胞的整個分化過程中都存在。Runx2能調(diào)節(jié)多種成骨細(xì)胞標(biāo)記基因，包括Alp、type I collagen、Ocn、Opn的表達(dá)及最終礦化的發(fā)生。Runx2能調(diào)控胚胎時期骨發(fā)育和出生后骨形成。Runx2基因敲除的小鼠由于成骨細(xì)胞分化受阻，不能通過任何膜內(nèi)骨化或軟骨內(nèi)骨化的途徑形成新骨[Ghosh S, Cell, 2002, 109Suppl (0092-8674(Print)):S81-96.]。這也證實Runx2是成骨分化所必需的。在人體中單個Runx2等位基因的失活將引起一種骨形成缺陷性疾病一鎖骨顱發(fā)育不全癥[Chen LF, et al EMBOJ, 2002, 21(23):6539-6548.] ο
[0006]此外，多種小分子化合物的促成骨分化效應(yīng)與Runx2激活有關(guān)。白藜蘆醇是一種在紅酒和大量植物中天然存在的植物多酚，能逆轉(zhuǎn)卵巢去勢大鼠的骨量丟失。體外實驗發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇活化的SIRT1-F0X03A復(fù)合物能結(jié)合至Runx2啟動子遠(yuǎn)端的FRE位點，從而上調(diào)Runx2的表達(dá)，該機(jī)制介導(dǎo)了白藜蘆醇誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化的效應(yīng)。另夕卜，也有報道指出，小檗堿通過P38MAPK通路活化的Runx2機(jī)制誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。在傳統(tǒng)中藥學(xué)中，淫羊藿因其強(qiáng)筋骨的功效而常常應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松。從該草本中提取出的一種異戊烯基多黃酮醇甙-淫羊藿苷，是其主要的藥理活性物質(zhì)。研宄發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷誘導(dǎo)成骨分化也依賴于Runx2。
[0007]Runx2參與了包括BMP通路、Wnt通路、Notch通路和Hedgehog等通路在內(nèi)的多條成骨分化和骨形成相關(guān)信號通路，并且可能是信號整合的匯集點[Lin GL, et al J Cell Biochem, 2011, 112(12):3491-3501.]。因而推測能有效上調(diào)Runx2轉(zhuǎn)錄活性的化合物，可能囊括了靶向以上各通路的各種活性化合物，其具有潛在的促進(jìn)成骨分化和骨形成效應(yīng)。
[0008]綜上所述，基于Runx2在調(diào)節(jié)成骨分化中的重要作用，本發(fā)明構(gòu)建了 Runx2轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)劑細(xì)胞篩選模型，并通過篩選，發(fā)現(xiàn)化合物N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺具有上調(diào)Runx2的轉(zhuǎn)錄活性，體外活性實驗表明，其具上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Runx2蛋白水平、上調(diào)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶ALP活性、上調(diào)成骨特異性分化基因的表達(dá)和增加鈣化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生，同時也發(fā)現(xiàn)該化合物可以抑制破骨細(xì)胞的形成，是一種潛在抗骨質(zhì)疏松候選化合物。本發(fā)明所述篩選模型以及基于該模型所發(fā)現(xiàn)的化合物N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺的抗骨質(zhì)疏松作用，迄今尚未見有相關(guān)報道，系本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)。所述化合物與臨床上使用的藥物相比，結(jié)構(gòu)沒有相似性，且該化合物具有促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的雙重抗骨質(zhì)疏松活性，可能具有新的抗骨質(zhì)疏松機(jī)制，存在廣闊的開發(fā)前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0009]本發(fā)明的目的是提供一種通過細(xì)胞篩選模型獲得的N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1, 2-唑-3-甲酰胺化合物在防治骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用。
[0010]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:
[0011]1，構(gòu)建Runx2轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)劑細(xì)胞篩選模型，并基于該模型發(fā)現(xiàn)N_(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺在制備Runx2轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)劑中的應(yīng)用；
[0012]2，N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1,2-唑-3-甲酰胺在制備Runx2蛋白水平上調(diào)劑中的應(yīng)用；
[0013]3，N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2_唑-3-甲酰胺在制備MC3T3-E1細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化的ALP活性上調(diào)劑中的應(yīng)用；
[0014]4，N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2_唑-3-甲酰胺在制備MC3T3-E1細(xì)胞誘導(dǎo)成骨特異性分化基因Alp，Ορη, Runx2上調(diào)劑中的應(yīng)用；
[0015]5，N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1,2-唑-3-甲酰胺在增加C3H10T1/2細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目中的應(yīng)用；
[0016]6，N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2_唑_3_甲酰胺在減少破骨細(xì)胞形成中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明所述Runx2轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)劑細(xì)胞篩選模型，可以應(yīng)用于高通量防治骨質(zhì)疏松疾病化合物篩選，基于該模型篩選出的化合物N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑-3-甲酰胺是一種Runx2轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)劑，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Runx2的蛋白、細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性、鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)目、成骨分化特異基因mRNA水平以及抑制破骨細(xì)胞形成，有望開發(fā)成為防治骨質(zhì)疏松疾病的藥物。
[0018]本發(fā)明還提供了以所述化合物為活性成分與藥學(xué)上可接受的載體組成的組合物在抗抗骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是，基于Runx2轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)的抗骨質(zhì)疏松化合物的發(fā)現(xiàn)具有新穎性，本發(fā)明首次闡述了所述化合物N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑-3-甲酰胺在骨質(zhì)疏松防治中的作用，在國內(nèi)外尚屬首次，對我國開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗骨質(zhì)疏松藥物具有現(xiàn)實意義。
【附圖說明】
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[0020]圖1:N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1,2-唑-3-甲酰胺上調(diào)模型中Runx2表達(dá)效應(yīng)
[0021]其中:縱坐標(biāo)-Runx2表達(dá)效應(yīng)上調(diào)率)；
[0022]橫坐標(biāo)-N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑_3_甲酰胺的濃度
[0023]圖2:N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2_唑-3-甲酰胺上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞中Runx2的蛋白水平
[0024]圖3:N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2_唑-3-甲酰胺上調(diào)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶ALP的活性
[0025]圖4:N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2_唑_3_甲酰胺增加鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)巨
[0026]圖5:N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1,2-唑-3-甲酰胺上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Alp，Opn，Runx2 的 mRNA 水平
[0027]圖6:N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2_唑_3_甲酰胺抑制破骨細(xì)胞形成圖7:N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺增加鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)目圖8:N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Alp，Ορη，
Runx2的mRNA水平
圖9:N-(環(huán)丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺抑制破骨細(xì)胞形成【具體實施方式】:
[0028]以下實施例可以使專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0029]《實施例1》上調(diào)Runx2轉(zhuǎn)錄活性細(xì)胞篩選模型的構(gòu)建及上調(diào)劑的發(fā)現(xiàn)
[0030]用于篩選的化合物源自但不限于國家新藥(微生物)篩選實驗室，將其溶于DMSO配置成20mM保存。通過Runx2轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)劑細(xì)胞篩選模型構(gòu)建、化合物篩選和熒光檢測等步驟，觀察化合物對模型中Runx2轉(zhuǎn)錄活性的影響。具體操作如下i
[0031]模型構(gòu)建:
[0032](I)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0033]根據(jù)p60SE2 質(zhì)粒[Geoffroy V, et al J B1l Chem, 1995, 270 (52): 30973 - 9.](如圖1)的信息，設(shè)計了引物以擴(kuò)增P60SE2質(zhì)粒6個重復(fù)的Runx2結(jié)合元件(60SE2)和下游的最小骨鈣素啟動子片段，并在引物上添加酶切序列。引物序列如下:0SE:正向引物(5’含 Xho I 酶切序列):5，-ccgctcgaggctgcaatcaccaaccac_3，(SEQ ID N0.1);反向引物(5，含 Hind III酶切序列):5，-cccaagcttttgtctgtctgcaccctc-3’ (SEQ ID N0.2)。PCR 結(jié)果顯示，利用該引物能擴(kuò)增獲得靶片段，并且特異性很好，條帶單一。因而直接將PCR產(chǎn)物用PCR純化試劑盒進(jìn)行提純，最后用20 μ I去離子水將產(chǎn)物從柱子上洗脫下來。將所有產(chǎn)物用Xho I和Hind III雙酶切過夜。載體pGL4.17(購自promega)同樣用Xho I和Hind III雙酶切過夜。次日，將酶切產(chǎn)物跑膠回收。將獲得的插入片斷與線性PGL4.17載體按照摩爾數(shù)比3:1在T4DNA Ligase作用下進(jìn)行連接，16°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH_5a感受態(tài)，于含有氨芐青霉素LB培養(yǎng)板上培養(yǎng)過夜。次日，挑選單克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，所得重組質(zhì)粒PGL4.17-0SE用Xho I和Hind III雙酶切的方法鑒定。結(jié)果如圖2，獲得3個重組質(zhì)粒#4，#7，#14。
[0034](2)瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒及熒光測定
[0035]分別將pGL4.17、p60SE2、重組質(zhì)粒#4、#7和#14在96孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時，用10 4 1/孔0?^-1^11(購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)培養(yǎng)基稀釋200ng DNA, 10 μ I/孔o(hù)pt1-MEM培養(yǎng)基稀釋0.5μ1 origene轉(zhuǎn)染試劑(購自美國Origene公司)，室溫孵育5min后與稀釋的DNA合并混勻，并繼續(xù)孵育20min。取處于生長對數(shù)期的MC3T3-E1細(xì)胞(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研宄所細(xì)胞培養(yǎng)中心)用胰酶消化后，加入含10% FBS的培養(yǎng)基適量，輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為2X 1