一種去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣支架及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程心臟瓣膜去細(xì)胞支架材料及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]目前組織工程心臟瓣膜的研宄主要是集中在以下幾方面:瓣膜支架制備及改性，種子細(xì)胞的選擇及培養(yǎng)，種子細(xì)胞與瓣膜支架材料的相互作用。而瓣膜支架的制備是整個(gè)組織工程心臟瓣膜研宄的前提，因此制備性能良好的瓣膜支架至關(guān)重要。
[0003]去細(xì)胞基質(zhì)由于其良好的生物相容性，并可為種子細(xì)胞黏附、增殖、分化等提供類似于體內(nèi)的基質(zhì)微環(huán)境，在組織工程學(xué)中得以廣泛應(yīng)用。目前，去細(xì)胞的組織工程心臟瓣膜支架大多為動(dòng)物的去細(xì)胞心臟瓣膜和去細(xì)胞心包，因其具有良好的生物學(xué)和力學(xué)性能，且來源廣泛，價(jià)格低廉，被越來越多的應(yīng)用于組織工程心臟瓣膜研宄。理想的去細(xì)胞瓣膜支架應(yīng)保持瓣膜細(xì)胞外基質(zhì)的完整性、良好的生物相容性、三維立體超微多孔結(jié)構(gòu)，進(jìn)而為種子細(xì)胞和組織生長提供足夠的空間條件，這些特點(diǎn)都是合成材料很難模仿的。
[0004]應(yīng)用去細(xì)胞瓣膜支架材料構(gòu)建組織工程心臟瓣膜，瓣膜的去細(xì)胞是至關(guān)重要的一步。根據(jù)去細(xì)胞方法性質(zhì)的不同，可以大體上將其分為物理、化學(xué)和酶學(xué)方法，在實(shí)際的工作過程中，根據(jù)需要也可以將不同的去細(xì)胞方法或者不同的試劑聯(lián)合應(yīng)用，以得到接近理想去細(xì)胞瓣膜的效果。目前去細(xì)胞常用的物理方法包括快速凍融，聲波降解等，化學(xué)方法常用試劑有曲拉通、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉、吐溫20等，酶學(xué)方法常用酶為低濃度的胰蛋白酶。但目前應(yīng)用最多的是化學(xué)方法中的表面活性劑，陽離子表面活性劑的毒性最大，其次是陰離子表面活性劑，非離子表面活性劑最小，但去污能力以非離子表面活性劑最強(qiáng)，其次是陰離子表面活性劑。
[0005]目前去細(xì)胞技術(shù)還不成熟，所有的去細(xì)胞方法都會(huì)導(dǎo)致瓣膜結(jié)構(gòu)的破壞和表面成分的潛在丟失，在一定程度上加速瓣膜的變性和鈣化，并且常用的去細(xì)胞試劑都具有一定的毒性，且去細(xì)胞時(shí)間較長大多需48小時(shí)甚至更長，單純的表面活性劑用于瓣膜及其類似組織去細(xì)胞效果往往不理想，很難保證細(xì)胞去除完全和同時(shí)保證瓣膜及類似組織的細(xì)胞外基質(zhì)的完整性及機(jī)械性能不會(huì)變化。因此尋求一種試劑用于心臟瓣膜去細(xì)胞，對(duì)于構(gòu)建去細(xì)胞組織工程心臟瓣膜支架尤為必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是:現(xiàn)有技術(shù)的去細(xì)胞方法都會(huì)導(dǎo)致瓣膜結(jié)構(gòu)的破壞和表面成分的丟失，一定程度上加速瓣膜的變性和鈣化，而且會(huì)產(chǎn)生一定的毒性。
[0007]為了解決上述問題，需要一種去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣支架，使其具備天然心臟瓣膜的相關(guān)性能，同時(shí)安全無毒。本發(fā)明的目的在于提供一種去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣支架，使其具備天然心臟瓣膜的相關(guān)性能，同時(shí)安全無毒，DNA含量大幅降低，極大的減少瓣膜植入體內(nèi)后的免疫排斥反應(yīng)。
[0008]具體來說，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案:
[0009]一種去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣支架，其經(jīng)聚乙二醇-聚己內(nèi)酯處理動(dòng)物的主動(dòng)脈瓣得到。
[0010]優(yōu)選的，所述的主動(dòng)脈瓣支架，其通過包含如下步驟的方法制備得到:
[0011](I)將動(dòng)物的主動(dòng)脈瓣置于含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液中處理；
[0012]以及
[0013](2)將所述的主動(dòng)脈瓣置于含核酸酶的緩沖液中處理。
[0014]優(yōu)選的，所述的動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。
[0015]一種去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣支架的制備方法，其包含如下步驟:
[0016](I)將動(dòng)物的主動(dòng)脈瓣置于含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液中處理；
[0017]以及
[0018](2)將所述的主動(dòng)脈瓣置于含核酸酶的緩沖液中處理。
[0019]優(yōu)選的，步驟(I)前，首先將所述的動(dòng)物主動(dòng)脈瓣置于4°C含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12?24小時(shí)。
[0020]優(yōu)選的，所述的培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基，其中抗生素含量為青霉素80U/ml?120U/ml 和鏈霉素 80 μ g/ml ?120 μ g/ml。
[0021]優(yōu)選的，步驟⑴中所述的含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液。
[0022]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液為三羥甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖液。
[0023]優(yōu)選的，所述的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的濃度為0.01mol/L?0.02mol/L0
[0024]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液中聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的濃度為0.5?2% (w/v) ο
[0025]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液中聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的濃度為I % (w/v) ο
[0026]優(yōu)選的，步驟⑴中，所述的主動(dòng)脈瓣在所述的含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液中，于常溫?37°C、50?10rpm振蕩處理12?36小時(shí)。
[0027]優(yōu)選的，步驟⑴中，所述的主動(dòng)脈瓣在所述的含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液中振蕩處理的溫度為37°C。
[0028]優(yōu)選的，步驟⑵中，所述的緩沖液包含0.lmg/ml?0.3mg/ml的脫氧核糖核酸酶I和10 μ g/ml?30 μ g/ml核糖核酸酶A0
[0029]優(yōu)選的，步驟(2)中，所述的主動(dòng)脈瓣在所述的核酸酶緩沖液中，于常溫?37°C、50?10rpm振蕩處理2?4小時(shí)。
[0030]優(yōu)選的，步驟(2)中，所述的主動(dòng)脈瓣在所述的核酸酶緩沖液中振蕩處理的溫度為 37。。。
[0031]優(yōu)選的，所述的制備方法還包括如下步驟:將步驟(I)得到的主動(dòng)脈瓣置于緩沖液中，于常溫?37°C、50?10rpm振蕩清洗12?36小時(shí)。
[0032]優(yōu)選的，步驟(I)得到的主動(dòng)脈瓣置于緩沖液中振蕩清洗的溫度為37°C。
[0033]優(yōu)選的，所述緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液。
[0034]優(yōu)選的，所述的緩沖液為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，所述的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的濃度為0.03?0.08mol/Lo
[0035]一種去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣支架，其由上述所述的制備方法制備得到。
[0036]優(yōu)選的，所述的主動(dòng)脈瓣支架在制備組織工程心臟瓣膜材料中的應(yīng)用。
[0037]優(yōu)選的，所述的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的分子量為4000?6000，其中聚乙二醇鏈段的分子量為2000?3000。
[0038]優(yōu)選的，所述的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯通過包括如下步驟的方法制備得到:
[0039]在氮?dú)猸h(huán)境下，以聚乙二醇和ε -己內(nèi)酯為原料，以辛酸亞錫為催化劑，90?100°C加熱得到聚乙二醇-聚己內(nèi)酯。
[0040]優(yōu)選的，所述的聚乙二醇和ε -己內(nèi)酯加熱反應(yīng)24?36小時(shí)。
[0041]本發(fā)明所用到的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(PEG-PCL)可以自合成，也可以從市面上購買得到。
[0042]聚乙二醇-聚己內(nèi)酯屬于非離子型表面活性劑，可降解、無毒，去污能力強(qiáng)，價(jià)格低廉，且其構(gòu)成部分PEG和PCL均已被美國FDA組織批準(zhǔn)在人體內(nèi)使用。
[0043]本發(fā)明應(yīng)用PEG-PCL低滲液對(duì)豬主動(dòng)脈瓣進(jìn)行去細(xì)胞處理，再經(jīng)高滲、核酸酶處理，從而制備出去細(xì)胞完全的瓣膜支架材料。
[0044]本發(fā)明中的PEG-PCL為非離子表面活性劑，去污能力強(qiáng)，無毒可降解，且降解產(chǎn)物無毒，不污染環(huán)境。PEG-PCL聚合物中PEG鏈段以重復(fù)的乙二醇為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，具有一定的表面活性，并且具有高度親水性、無毒、無抗原性和免疫原性及良好組織相容性等優(yōu)點(diǎn)。組織應(yīng)用PEG-PCL浸泡，在去細(xì)胞的同時(shí)又能有效保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分，減輕植入體內(nèi)后的免疫排斥反應(yīng)。PEG與疏水性PCL鏈段結(jié)合后的共聚物PEG-PCL作為非離子表面活性劑，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。PCL和PEG均已被美國FDA組織批準(zhǔn)在人體內(nèi)使用，且PEG-PCL是經(jīng)國際認(rèn)證無毒害，具有良好的生物降解性和相容性。
[0045]本發(fā)明所制備的去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣支架材料，經(jīng)生物學(xué)性能和力學(xué)性能評(píng)價(jià)，其中生物學(xué)性能檢測包括蘇木素-伊紅(HE)染色、MASSON染色，掃描電子顯微鏡觀察瓣膜去細(xì)胞情況，測定瓣膜DNA含量、含水量、膠原蛋白含量、彈性蛋白含量，細(xì)胞毒性以及瓣膜溶血實(shí)驗(yàn)；力學(xué)性能測試包括最大拉伸強(qiáng)度、斷裂強(qiáng)度、斷裂伸長率和彈性模量的測定。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明制備的去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣支架具備良好的生物學(xué)性能和力學(xué)性能，達(dá)到本發(fā)明的目的。
[0046]本發(fā)明所取得的有益效果:
[0047](I)本發(fā)明首次應(yīng)用可降解無毒的表面活性劑PEG-PCL作為去細(xì)胞試劑，并成功地對(duì)豬主動(dòng)脈瓣進(jìn)行去細(xì)胞處理，細(xì)胞去除完全，去細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)保留完全且具備良好的生物相容性和力學(xué)性能，此為構(gòu)建組織工程心臟瓣膜支架材料提供了一種新的去細(xì)胞方法。
[0048](2)本發(fā)明中的非離子表面活性劑PEG-PCL作為一種去細(xì)胞試劑，與目前常用的去細(xì)胞試劑(曲拉通、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉、胰酶等)相比，該試劑無毒無刺激性，可降解且降解產(chǎn)物無毒，去細(xì)胞方法簡單易行，便于去細(xì)胞支架材料的批量生產(chǎn)，并且該去細(xì)胞溶液便于消毒。PEG-PCL可自行合成，合成方法簡單，市場上亦有成品出售，價(jià)格低廉。
[0049](3)本發(fā)明所制備去細(xì)胞瓣的DNA含量與新鮮正常瓣膜相比大幅降低(P
<0.05)，說明本發(fā)明的去細(xì)胞方法能將瓣膜的免疫原性大幅降低，可減少瓣膜植入體內(nèi)后的免疫排斥反應(yīng)。
[0050](4)應(yīng)用本發(fā)明中的非離子表面活性劑PEG-PCL作為去細(xì)胞試劑，可解決目前常用去細(xì)胞試劑毒性殘留問題，應(yīng)用PEG-PCL作為去細(xì)胞試劑在生物支架材料的構(gòu)建中具有重要的意義。
【附圖說明】
[0051]圖1為實(shí)施例一的共聚物PEG-PCL的紅外光譜圖。
[0052]圖2為實(shí)施例一的共聚物PEG-PCL的核磁共振氫譜圖。
[0053]圖3A為實(shí)施例一所述對(duì)照組新鮮正常主動(dòng)脈瓣HE染色圖，圖3B為實(shí)驗(yàn)組去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣HE染色圖。
[0054]圖4A為實(shí)施例一所述對(duì)照組新鮮正常主動(dòng)脈瓣MASSON染色圖，圖4B為實(shí)驗(yàn)組去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣MASSON染色圖。
[0055]圖5A為實(shí)施例一所述對(duì)照組新鮮正常主動(dòng)脈瓣掃描電子顯微鏡圖，圖5B為實(shí)驗(yàn)組去細(xì)胞主動(dòng)脈辧掃描電子顯微鏡圖。
[0056]圖6A為實(shí)施例一拉