治療和預(yù)防創(chuàng)傷性腦損傷性神經(jīng)元損害的組合物和方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】治療和預(yù)防創(chuàng)傷性腦損傷性神經(jīng)元損害的組合物和方法
[0001] 政府利益
[0002] 本發(fā)明榮獲美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研宄院資助，資助號(hào)NS072631。政府對(duì)本發(fā)明具有一定 的權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0003] 創(chuàng)傷性腦損傷（TBI)是導(dǎo)致死亡及兒童和年輕人殘疾的主要原因（Aitken 等，2009McCarthy等，2006)。TBI誘發(fā)腦內(nèi)（包括海馬和皮質(zhì)區(qū)域）的神經(jīng)元死亡。TBI不 僅能通過(guò)直接組織缺損引起原發(fā)性損傷（Hall等，2004 ;Hall等，2005b;Singh等，2006)， 還通過(guò)該原發(fā)事件在存活的細(xì)胞中引發(fā)繼發(fā)性損傷（Faden等，1989 ;Fujimoto等，2004b; Hall等，2005b;Marion等，1997)。損傷廣泛存在于腦組織中，如大腦皮層和海馬區(qū)域，此 損傷在人類(lèi)（Ariza等，2006;Bigler等，1997;Isoniemi等，2006;Tate和Bigler, 2000 ; Umile等，2002;Wilde等，2007)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（Bonislawski等，2007;Hall等，2005b; Lowenstein等，1992 ;Saatman等，2006a)中均可見(jiàn)，且導(dǎo)致認(rèn)知、感覺(jué)以及運(yùn)動(dòng)功能的缺 損（Greve和Zink, 2009 ;Hall等，2005b;Singh等，2006)。目前尚未出現(xiàn)FDA批準(zhǔn)的針對(duì) TBI后癥狀的有效治療。
[0004] 文獻(xiàn)已表明在實(shí)驗(yàn)性TBI后會(huì)誘發(fā)細(xì)胞興奮性毒性，后者導(dǎo)致了損傷后細(xì)胞的快 速死亡（Palmer等，1993)。細(xì)胞興奮性毒性可引起細(xì)胞凋亡還是壞死取決于起始刺激的強(qiáng) 度和細(xì)胞群體的特性（Ankarcrona等，1995 ;Bonfoco等，1995 ;Martin等，1998)。在小鼠 TBI模型中，大多數(shù)的神經(jīng)元死亡發(fā)生于TBI后24小時(shí)內(nèi)，此后，細(xì)胞死亡持續(xù)在一個(gè)較低 水平至少另外兩周（Zhou等，2012)。大部分死亡的細(xì)胞并未顯示出凋亡的形態(tài)學(xué)特征，且 凋亡標(biāo)記只在小部分死亡細(xì)胞亞群中為陽(yáng)性。與之相對(duì)，大多數(shù)的細(xì)胞死亡為壞死性死亡， 此結(jié)果提示，中度TBI誘發(fā)的主要是快速壞死性細(xì)胞死亡。
[0005]腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)是生長(zhǎng)因 子家族的成員之一。它在成年大腦內(nèi)廣泛分布且活躍，包括海馬和皮層（Egan等，2003; Huang等，1999 ;Hyman等，1991)。BDNF對(duì)神經(jīng)元起多種重要的作用，例如有助于成熟神經(jīng) 元（Barde, 1994;Ghosh等，1994;Lindholm等，1996;Shulga等，2008)和未成熟神經(jīng)元 (Gao和Chen, 2009;Kirschenbaum和Goldman, 1995;Liu等，2003)的生存。此外，無(wú)論對(duì) 成熟嚙齒類(lèi)動(dòng)物或人類(lèi)皮層，BDNF都是海馬發(fā)育過(guò)程中最豐富的營(yíng)養(yǎng)因子（Maisonpierre 等，1990Jimmusk等，1994 ;Webster等，2002)。若在海馬發(fā)育階段敲除bdnf基因， BDNF表達(dá)的減少會(huì)加重TBI后的神經(jīng)元死亡（Gao和Chen, 2009)。此結(jié)果說(shuō)明，BDNF參 與調(diào)控了神經(jīng)元的生存，并有望用于保護(hù)神經(jīng)元，使其在TBI后免于死亡。7, 8-二羥黃酮 (7, 8-dihydroxyflavone，DHF)是一個(gè)仿BDNF的小分子，已有研宄表明該小分子能保護(hù)野 生型神經(jīng)元免于凋亡（Jang等，2010)。對(duì)于嚙齒類(lèi)動(dòng)物的壓力（Andero等，2012)、抑郁 (Liu等，2010)、高齡（Zeng等，2012a;Zeng等，2012b;Zeng等，2011)和阿爾茲海默病模 型（Devi和Ohno, 2012)，DHF處理有助于改善其神經(jīng)功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]在此公開(kāi)的信息為，DHF減少了TBI后的神經(jīng)元死亡（壞死性死亡為主）。用DHF 處理TBI小鼠，促進(jìn)了其BDNF受體--酪氨酸相關(guān)激酶B(Tyrosine-relatedkinaseB， TrkB)的磷酸化（Yan等，1997)，同時(shí)顯著減少了TBI后24小時(shí)內(nèi)海馬的神經(jīng)元死亡和皮 層的組織缺損。另一方面，抑制BDNF信號(hào)通路可削弱DHF的神經(jīng)保護(hù)作用。
[0007]本發(fā)明包括了創(chuàng)傷性腦損傷的治療方法和組合物。具體而言，在此公開(kāi)的方法抑 制和/或防止創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)元死亡的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療TBI的方法包 括對(duì)TBI發(fā)生后的受試對(duì)象給予DHF或其衍生物。DHF或其衍生物也可在臨床環(huán)境下給藥， 其中受試對(duì)象在TBI后被帶至臨床機(jī)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，DHF或其衍生物通過(guò)腹腔注 射的方式在受試對(duì)象的損傷側(cè)給藥。
[0008]在一個(gè)實(shí)施方案中，治療TBI的方法包括預(yù)防性給予DHF或其衍生物，由此DHF或 其衍生物在TBI的發(fā)生前給藥。TBI在一些運(yùn)動(dòng)和職業(yè)中很常見(jiàn)，比如在橄欖球、足球、拳 擊、冰球和武術(shù)等運(yùn)動(dòng)中，頭部損傷時(shí)常發(fā)生。在許多情況中，TBI是由于頭部的反復(fù)撞擊 引起。因此，一個(gè)實(shí)施方案包括在運(yùn)動(dòng)進(jìn)行前或者途中將DHF或其衍生物給予運(yùn)動(dòng)員。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了DHF或其衍生物、或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯類(lèi)、 溶劑化物、互變異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體、包合物、水合物、多晶或前體藥物在制備用于在TBI可 能發(fā)生之前預(yù)防或抑制TBI后的神經(jīng)元死亡的藥物或用于治療TBI后的受試對(duì)象的藥物中 的用途。
[0010]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了DHF或其衍生物、或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯類(lèi)、 溶劑化物、互變異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體、包合物、水合物、多晶或前體藥物，其用于在TBI可能 發(fā)生之前預(yù)防或抑制TBI后的神經(jīng)元死亡或用于治療TBI后的受試對(duì)象。
[0011]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了用于在TBI可能發(fā)生之前預(yù)防或抑制TBI后的神 經(jīng)元死亡或用于治療TBI后的受試對(duì)象的組合物，其包含有效量的DHF或其衍生物、或其藥 學(xué)上可接受的鹽、酯類(lèi)、溶劑化物、互變異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體、包合物、水合物、多晶或前體藥 物。在一個(gè)方面，所述組合物為藥物組合物或者飲料，比如運(yùn)動(dòng)飲料。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1顯示體外DHF保護(hù)神經(jīng)元免于谷氨酸/甘氨酸介導(dǎo)的細(xì)胞興奮性毒性死亡。 (a)明場(chǎng)圖顯示DMSO處理的對(duì)照組細(xì)胞。（b)PI染色檢測(cè)DMSO處理的對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞 死亡。（c)a圖和b圖的疊加。（d)明場(chǎng)圖顯示經(jīng)谷氨酸和甘氨酸處理誘導(dǎo)細(xì)胞興奮性毒性 的細(xì)胞給予DMSO預(yù)處理作為對(duì)照組。（e)PI染色檢測(cè)經(jīng)谷氨酸和甘氨酸處理和DMSO預(yù)處 理對(duì)照組的細(xì)胞死亡。（f)d圖和e圖的疊加。（g)明場(chǎng)圖顯示經(jīng)谷氨酸和甘氨酸處理誘導(dǎo) 細(xì)胞興奮性毒性的細(xì)胞給予DHF預(yù)處理。（h)PI染色檢測(cè)經(jīng)谷氨酸/甘氨酸處理以及DHF 預(yù)處理的細(xì)胞死亡。（i)g圖和h圖的疊加。（j)明場(chǎng)顯示未經(jīng)谷氨酸和甘氨酸處理誘導(dǎo)細(xì) 胞興奮性毒性而給予DHF處理的細(xì)胞。（k)PI染色檢測(cè)未經(jīng)谷氨酸和甘氨酸處理而用DHF 處理的細(xì)胞死亡。（l)j圖和k圖的疊加。（m)DMSO組、谷氨酸/甘氨酸處理組、谷氨酸/甘 氨酸/DHF組和DHF組的細(xì)胞死亡計(jì)數(shù)。（n)對(duì)不同濃度的DHF處理的組的細(xì)胞死亡計(jì)數(shù)， 以評(píng)估DHF的劑量對(duì)經(jīng)谷氨酸/甘氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞興奮性毒性的細(xì)胞保護(hù)作用的影響。
[0013] 圖2顯示DHF處理減輕了TBI后皮層的損傷。小鼠在TBI造模前接受在DMSO中 的DHF的預(yù)處理或接受無(wú)DHF的DMSO(作為對(duì)照）的預(yù)處理。（a)無(wú)DHF的DMSO預(yù)處理的 損傷中心腦片的焦油紫染色。（b)DHF預(yù)處理的損傷中心腦片的焦油紫染色。（c)損傷側(cè)與 對(duì)側(cè)皮層的缺損面積比例對(duì)照。
[0014] 圖3顯示DHF處理減少了TBI后海馬的細(xì)胞死亡。TBI造模后24小時(shí)，腦片經(jīng)FJB 染色以檢測(cè)海馬內(nèi)的細(xì)胞死亡。（a)假手術(shù)組的小鼠腦片，片中可見(jiàn)海馬齒狀回。腦片經(jīng) DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）復(fù)染呈藍(lán)色以顯示細(xì)胞核。（b)TBI造模而不給予DHF處 理的小鼠，F(xiàn)JB染色以檢測(cè)該組小鼠海馬齒狀回中的FJB陽(yáng)性細(xì)胞（綠色）。腦片經(jīng)DAPI復(fù) 染呈藍(lán)色以顯示細(xì)胞核。（C)TBI造模前接受DHF預(yù)處理的小鼠，F(xiàn)JB染色以檢測(cè)該組小鼠 海馬齒狀回中的FJB陽(yáng)性細(xì)胞（綠色）。腦片經(jīng)DAPI復(fù)染呈藍(lán)色以顯示細(xì)胞核。（d)TBI造 模前接受DMSO預(yù)處理的小鼠，F(xiàn)JB染色以檢測(cè)該組小鼠海馬齒狀回中的FJB陽(yáng)性細(xì)胞（綠 色）。腦片經(jīng)DAPI復(fù)染呈藍(lán)色以顯示細(xì)胞核。（e)對(duì)海馬中不同分區(qū)的FJB陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì) 數(shù)結(jié)果。
[0015] 圖4顯示DHF處理增加了TBI后海馬內(nèi)新生未成熟神經(jīng)元的數(shù)量。造模后24小 時(shí)，用DCX特異性抗體進(jìn)行免疫染色，以展示小鼠海馬齒狀回中的新生未成熟神經(jīng)元。（a) 假手術(shù)組小鼠的海馬齒狀回中的Dcx陽(yáng)性新生未成熟神經(jīng)元（紅色）。腦片經(jīng)DAPI復(fù)染 呈藍(lán)色以顯示細(xì)胞核。（b)TBI損傷組小鼠的海馬齒狀回中的Dcx陽(yáng)性新生未成熟神經(jīng)元 (紅色）。腦片經(jīng)DAPI復(fù)染呈藍(lán)色以顯示細(xì)胞核。