(4) :140-52, 2011)。在 現(xiàn)有技術(shù)中，可以找到下列抑制策略：
[0010] 1-配體的中和，其中使用其受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性形式（US 2002/0004037 和 US 2007/0244042)、抗-TGF 0 抗體（US 2002/076858、US 2005/0276802)或阻斷所述細(xì) 胞因子的基因的翻譯的寡核苷酸（US 2004/0006036和US 2007/0155685);
[0011] 2-信號傳導(dǎo)的阻斷，其中使用與T0RI/ALK5的激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合的小分子（US 2006/0057145、US 2005/0136043、US 2006/0234911);
[0012] 3-受體II的阻斷，其中采用識別其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體（US 2010/0119516、US 2009/7579186)〇
[0013] 迄今為止還沒有報道過使用配體TGF0的突變蛋白作為信號傳導(dǎo)的拮抗劑的抑 制策略。
[0014] 發(fā)明簡述
[0015] 本發(fā)明基于這樣的科學(xué)發(fā)現(xiàn)：TGFMTGFM、TGF0 2和TGF0 3)家族的突變型變 體可以抑制其天然同源物的功能。發(fā)明人首次在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，TGF0的突變型變體可 以相當(dāng)大程度地抑制由天然變體誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)并由此中和其生物學(xué)效應(yīng)。該發(fā)現(xiàn)為在其 中配體TGF 0具有有害活性的疾病例如癌癥、纖維化或慢性感染中調(diào)節(jié)TGF 0信號傳導(dǎo)的 新策略奠定了基礎(chǔ)。
[0016] 本發(fā)明涉及這樣的多肽，其與人TGF0共享一級序列，除了一些氨基酸被突變，以 消除或相當(dāng)大程度地降低其通過I型受體ALK5進(jìn)行信號傳導(dǎo)的能力。這些TGF0的突變 型變體保持了其以高親和力與受體T 0 RII和T 0 RIII結(jié)合的能力，但不能夠進(jìn)行信號傳 導(dǎo)，因為其不與I型受體ALK5相互作用，從而通過經(jīng)由與高親和力受體Tf3 RII和Tf3 RIII 的結(jié)合而與天然變體競爭來負(fù)地調(diào)節(jié)天然變體的信號傳導(dǎo)。本發(fā)明還包括這些突變型變體 (單獨(dú)地或者與疫苗或其他治療形式相組合地）用于治療其中TGF0經(jīng)證明是重要的疾病 例如癌癥、纖維化或慢性感染的治療應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的新穎性在于提供了一種新的治療策略，以在其中TGF0的功能降低了保 護(hù)性免疫應(yīng)答（要么是天然的，要么是由疫苗接種誘導(dǎo)的）或者誘導(dǎo)了過量的組織修復(fù)和 纖維化的疾病中，調(diào)節(jié)TGF0信號傳導(dǎo)并因此調(diào)節(jié)一些腫瘤的侵入和轉(zhuǎn)移能力以及一些免 疫系統(tǒng)和結(jié)締組織細(xì)胞的活性。上面所提及的抑制策略中沒有一個使用配體TGF0的突 變蛋白作為信號傳導(dǎo)的拮抗劑。本發(fā)明的TGF0的突變體是實際上自身的蛋白質(zhì)并因此 具有低的免疫原性，這使得針對其的抗體應(yīng)答的風(fēng)險降低至最小。對于受體系統(tǒng)的高度特 異性降低了不希望的毒性（這是在基于小尺寸的抑制劑的策略中所共同的）。這些TGF0 的突變型變體保持了至少天然TGFM和TGF0 3的親和力（6-10pM)這樣的級別的與受體 T 0 RII的結(jié)合親和力。該親和力是用受體或配體抑制策略、單克隆抗體或其他藥物難以超 過的。令人驚訝地，本發(fā)明的作者發(fā)現(xiàn)，這些TGF0的突變型變體保留了與受體T0RIII和 T 0 RII相互作用的能力，這構(gòu)成了超過抗受體T 0 RII的抗體的優(yōu)點(diǎn)，因為所述突變蛋白阻 斷了天然配體與細(xì)胞表面的所有可能的結(jié)合位點(diǎn)。
[0018] 發(fā)明詳述
[0019] 本發(fā)明涉及多肽，其拮抗由受體ALK5介導(dǎo)的天然配體TGF e的活性，并且具有大 于90%的相對于天然配體TGF0的氨基酸序列而言的同源性。本發(fā)明的多肽在其一級氨 基酸序列中具有至少一個在選自下列的殘基之一處的突變 ：￥6、130、132、151、151、067和 LlOl。在本發(fā)明的一個特別的實施方案中，原始氨基酸殘基突變?yōu)檫x自下列的氨基酸殘基 之一：
[0020] 對于位置6 :A ;
[0021] 對于位置 30 :N、R、K、D、Q、L、S、P、V、I、G、C、T、A、E ;
[0022] 對于位置32 :A ;
[0023] 對于位置 51 :Q、W、Y、A ;
[0024] 對于位置 67 :H、F、Y、W ;和
[0025] 對于位置 101:A、E。
[0026] 本發(fā)明的另一個目標(biāo)為多肽，其中在與受體TGF 0 RII和/或TGF 0 RIII的相互作 用界面處添加突變，以增加其與所述受體的親和力。
[0027] 此外，本發(fā)明還涉及用于治療癌癥、伴有纖維化的疾病和慢性感染性疾病的藥物 組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含有在本發(fā)明中所描述的多肽或多肽混合物和用 于其應(yīng)用的藥學(xué)上合適的載料。所述多肽可以共價地連接至載體蛋白，并且該蛋白可以為 白蛋白或人免疫球蛋白的Fc區(qū)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽可以被PEG化。
[0028] 最后，本發(fā)明涉及所描述的多肽在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物在 治療癌癥、伴有纖維化的疾病和慢性感染性疾病中有用，以及對于代替天然TGF0來增強(qiáng) 對疫苗的細(xì)胞和/或體液應(yīng)答來說有用，尤其是當(dāng)待增強(qiáng)的疫苗為用于癌癥的治療性疫苗 時。
[0029] TGF 0的類似多肽的獲得
[0030] 本發(fā)明涉及大小為112個氨基酸的多肽。這些多肽保持高的與各種不同的天然 TGF 0分子的序列同一性，大于90%的同一性。在其序列的一個區(qū)域中包括1至6個突變， 相對于天然TGF0而言。選擇置換原始?xì)埢臍埢?，以便具有與原始氨基酸非常不同的物 理化學(xué)特性，非極性殘基置換成極性殘基、帶電荷電的殘基置換成不帶電荷的殘基、大殘基 置換成小殘基、酸性殘基置換成堿性殘基的改變。
[0031] 從在與其受體T 0 RII和ALK5的復(fù)合物中的天然TGF 0 I、TGF 0 2和TGF 0 3的三維 結(jié)構(gòu)（存放在數(shù)據(jù)庫TOB中）開始來設(shè)計這些多肽（也可以稱為TGF0的突變蛋白）。僅 在這樣的TGF0的位置處引入突變，所述位置相應(yīng)于明顯暴露于溶劑的氨基酸并且構(gòu)成與 受體ALK5(但不是T 0RII)的結(jié)合區(qū)域的一部分。通過使用公有領(lǐng)域的生物信息學(xué)程序， 這些殘基被預(yù)測為在與ALK5的相互作用中是重要的。下表顯示了被預(yù)測為在相互作用中 重要的與ALK5的結(jié)合界面的殘基和影響結(jié)合的可能突變。用這些結(jié)果制作了理論突變蛋 白的數(shù)據(jù)庫并且選擇了具有最高體外拮抗劑效力的突變蛋白。
[0032] 表1 :對于與T 0 RI/ALK5的相互作用來說重要的TGF 0序列的氨基酸和根據(jù)理論 預(yù)測將會使結(jié)合不穩(wěn)定的突變。
[0033]
[0034] 本發(fā)明的多肽可以通過各種不同的途徑來獲得，尤其是通過蛋白質(zhì)的化學(xué)合成。 還可以通過基因工程技術(shù)來獲得，例如在細(xì)菌例如大腸桿菌（E. coli)中作為內(nèi)含體或者 在哺乳動物細(xì)胞例如CHO和HEK293中表達(dá)它們，其中使用在現(xiàn)有技術(shù)中所積攢的任何轉(zhuǎn)染 方案。還可以通過借助于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的定向誘變技術(shù)來獲得在特定位置處的點(diǎn)突變。
[0035] 通過其生物學(xué)活性來選擇天然TGF 0的類似多肽
[0036] 從體外和體內(nèi)實驗開始來選擇本發(fā)明的多肽，以同時具有下列特性：
[0037]-這些TGF0的突變型變體（在本發(fā)明中也稱為突變蛋白）保持了其與受體 T0RII結(jié)合的能力。該結(jié)合能力可以通過商購可得的針對受體T0RII的鏈的ELISA測定 法直接地來進(jìn)行評價，或者在對于該受體來說陽性的細(xì)胞群上間接地來進(jìn)行評價。對于受 體T0RII的識別水平應(yīng)當(dāng)與天然TGF0相當(dāng)。
[0038] -這些突變蛋白應(yīng)當(dāng)阻斷配體TGF 0 (TGF0 1、TGF 0 2、TGF 0 3)與受體T 0 RII的 結(jié)合。這可以通過競爭性ELISA直接地來進(jìn)行測量，其中用配體TGF0中的每一種（商購 可得的）包被平板并評價所述突變蛋白抑制T 0 RII與所述配體結(jié)合的能力。
[0039]-這些TGF 0的突變型變體喪失了或相當(dāng)大程度地降低了其通過受體T 0 RI進(jìn)行 信號傳導(dǎo)的能力。該特性可以在通過Western的免疫檢測測定法中直接地進(jìn)行評價，其中 定量在用所述突變蛋白或用天然TGF0進(jìn)行處理的鼠類譜系腫瘤細(xì)胞4T1和人類譜系腫瘤 細(xì)胞MDA-MB231的裂解液中的磷酸化的Smad2和Smad3的水平。這些突變蛋白應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)比 天然TGF 0小至少100倍的Smad2和Smad3的磷酸化。所提及的特性還可以在體外在對于 細(xì)胞系CTLL-2的由IL-2誘導(dǎo)的增殖的抑制測定法中來進(jìn)行評價。這些突變體應(yīng)當(dāng)具有比 天然TGF 0低至少100倍的抑制活性。
[0040] -這些TGF 0的突變型變體具有抑制由配體TGF 0中的每一種（TGF0 1、TGF 0 2、 TGF0 3)誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的能力。該特性可以在通過Western的免疫檢測測定法中直接地 進(jìn)行評價，其中定量在用所述突變蛋白或用天然TGF0進(jìn)行處理的鼠類譜系腫瘤細(xì)胞4T1 和人類譜系腫瘤細(xì)胞MDA-MB231的裂解液中的磷酸化的Smad2和Smad3的水平。在50ng/ mL-10yg/mL的突變蛋白濃度的范圍內(nèi)，所述突變蛋白應(yīng)當(dāng)展現(xiàn)出至少100倍地抑制由商 業(yè)配體誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的能力。
[0041] -這些TGF0的突變型變體具有體外抗腫瘤效應(yīng)。它們可以抑制用天然配體進(jìn)行 處理或未處