的標(biāo)準(zhǔn)Ig Y1載體（Science 301 (5638):1374-1377)以編碼后面有6x-His 標(biāo)簽的IgGlC11I域生成的6xHis-IgCy 1表達(dá)載體中。將編碼PGT121eM(S32Y、K53D、S54R、 N58T、H97R、T1001Y)和 10-1074GM(Y32S、D53K、R54S、T58N、R97H、Y1001T)突變體抗體的 IgH DNA片段以合成小基因（IDT)獲得，并亞克隆入Ig Y1表達(dá)載體中。
[0135] 下文列出10-1074eM的重鏈序列，其中突變是加下劃線的。10-1074 eM的輕鏈序列 與10-1074的輕鏈序列相同。
[0136] QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCSVS ⑶ SMNNSYWTWIRQSPGKGLEWIGYISKSESAPNPSLNSRVVI SRDTSKNQLSLKLNSVTPADTAVYYCATARHGQRIYGVVSFGEFFTYYSMDVWGKGTTVTVSS
[0137] 通過(guò)使用聚乙烯亞胺（PEI)沉淀法（PLoS One 6(9) :e24078)將IgH和IgL表達(dá) 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入指數(shù)生長(zhǎng)的HEK 293T細(xì)胞（ATCC，CRL-11268)中來(lái)生成抗體和Fab片段。 使用蛋白G Sepharose珠 （GE Healthcare)依照制造商的用法說(shuō)明親和純化IgG抗體。使 用HisPur?鈷樹(shù)脂（Cobalt Resin) (Thermo scientific)親和純化Fab片段，如下文描述 的。
[0138] HIV-IEnv 蛋白
[0139] 使用QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖校⊿tratagene)依照制造商的用法說(shuō)明將丙氨酸 突變?cè)谖恢?301 至 303 (Asn-Asn-Thr)、324 至 325 (Gly-Asp)、和 332 (Asn) (HXBc2 氨基酸編 號(hào)方式）處引入 pYU_2 gpl20 載體（J. Sodroski, Harvard Medical School 的贈(zèng)品）中。使 用相同的規(guī)程通過(guò)在位于Asr^eZgpl2ci和Asn406 ^5l2tl之間的每個(gè)PNGS處將單丙氨酸突變引 入pYU-2 gpl20N332A載體來(lái)生成"雙重聚糖"突變體。通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)定點(diǎn)突變。
[0140] 使用編碼 YU-2 gpl40 (Journal of virology 74(12) :5716-5725)、YU-2gpl20、 HXB2c gpl20core (Nature 393 (6686) : 648-659) , HXB2c 2CCcore (PLoS Pathog 5(5):e100 0445)蛋白、和YU-2 gpl20突變體蛋白的表達(dá)載體來(lái)轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞。為 了生成僅高甘露糖YU-2 gpl20蛋白（gpl20kif)，在轉(zhuǎn)染時(shí)添加25μΜ幾夫堿（Enzo Life Sciences)。將培養(yǎng)物上清液收獲，并使用基于離心的過(guò)濾裝置（Vivacell 100, Sartorius Stedim Biotech Gmbh)濃縮，該裝置容許樣品對(duì)IOmM咪挫、50mM磷酸鈉、300mM氯化鈉 （pH 7. 4)的緩沖液更換。通過(guò)使用HisPur?鈷樹(shù)脂（Thermo scientific)依照制造商的用法 說(shuō)明進(jìn)行親和層析純化蛋白質(zhì)。
[0141] 對(duì)于脫糖基化反應(yīng)，將PBS中的50yg HEK 293T細(xì)胞生成的YU-2 gpl20用 在其不含變性劑的相應(yīng)反應(yīng)緩沖液中的200U PNG酶F (New England Biolabs)或 10, OOOU Endo Hf (New England Biolabs)于 37°C消化過(guò)夜。在施用離心濾器Amicon? Ultra, Millipore)對(duì)PBS進(jìn)行緩沖液更換后，通過(guò)使用4-12% NuPAGE凝膠（Invitrogen) 的SDS-PAGE，接著通過(guò)銀染色（Pierce銀染色試劑盒，Thermo Scientific)檢查經(jīng)糖苷酶 處理的 gpl20s(200ng)。
[0142] ELISA
[0143] 用PBS中的IOOng/孔純化的gpl20包被高結(jié)合96孔ELISA板（Costar)過(guò)夜。在 清洗后，將板用2% BSA、1 yM EDTA、0. 05% Tween-PBS(封閉緩沖液）封閉2小時(shí)，然后與 26. 7nM濃度的IgG (或?qū)τ谑褂肶U-2 gp 120雙重聚糖突變體的ELISA為427. 2nM)和PBS 中的7個(gè)連續(xù)1:4稀釋物一起溫育2小時(shí)。在清洗后，通過(guò)與綴合有HRP的山羊抗人IgG 抗體（Jackson ImmunoReseach)(在封閉緩沖液中為0. 8 μ g/ml) -起溫育1小鼠，并通過(guò) 添加 HRP生色底物（ABTS溶液，Invitrogen)顯現(xiàn)板（PLoS One 6(9): e24078)。使用先前 描述的肽-ELISA法測(cè)試抗體對(duì)選擇的gpl20V3重疊肽的結(jié)合。
[0144] 對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)ELISA，經(jīng)gpl20包被的板用封閉緩沖液封閉2小時(shí)，然后與PBS中抗體 競(jìng)爭(zhēng)物的1:2連續(xù)稀釋溶液（5. 2至667nM的IgG濃度范圍）中的生物素化的抗體（對(duì)于 PGT121 濃度為 26. 6nM，對(duì)于 10-1074 為 0. 21nM，對(duì)于 10-996 為 0. 43nM 以及對(duì)于 10-1369 為I. 67nM) -起溫育2小時(shí)。使用綴合有HRP的鏈霉親合素 （Jackson ImmunoReseach)(以 封閉緩沖液中的〇.8μg/ml)顯現(xiàn)板，如上文描述的。至少一式兩份實(shí)施所有實(shí)驗(yàn)。
[0145] 聚糖微陣列分析
[0146] 通過(guò)在兩個(gè)水平上（2和5fmol/點(diǎn)）一式兩份將與脂質(zhì)連接的聚糖探針（擬糖 脂（neoglycolipid))機(jī)器打印到硝酸纖維素包被的玻璃載玻片上（Methods Mol Biol 808:117-136)來(lái)產(chǎn)生微陣列。用含有15種源自高甘露糖和復(fù)合型的N-聚糖的擬糖脂的 微陣列實(shí)施結(jié)合測(cè)定法。圖7A中顯示了探針的序列。簡(jiǎn)言之，以50μg/ml測(cè)試抗體，并且 用生物素化的抗人IgG(Vector)，接著用經(jīng)AlexaFluor 647標(biāo)記的鏈霉親合素 （Molecular Probes)檢測(cè)結(jié)合。
[0147] 表面等離振子共振
[0148] 使用 Biacore TlOO (Biacore, Inc)實(shí)施實(shí)驗(yàn)（Nature 467(7315) :591-595)。簡(jiǎn) 言之，將YU-2 gpl40和gpl20蛋白在CM5芯片（Biacore，Inc.)上以300RU的偶聯(lián)密度用 伯胺偶聯(lián)。分別以1 μ M和10 μ M，以35 μ Ι/min的流速以3分鐘結(jié)合和5分鐘解離相在流 動(dòng)池上注射抗gpl20IgG和種系前體（GL)。通過(guò)以50 μ Ι/min的流速30秒注射IOmM甘氨 酸-HCl pH 2. 5再生傳感器表面。在不進(jìn)行體積反射指數(shù)（bulk reflective index, RI) 校正的情況中使用1:1結(jié)合模型（Biacore TlOO評(píng)估軟件）在扣除背景后自動(dòng)力學(xué)分析計(jì) 算解離（Ms，）、結(jié)合（ka(M^)和結(jié)合常數(shù)（K d(M)或Ka (if1)。使用1:1結(jié)合模型計(jì)算的 二價(jià)IgG的結(jié)合常數(shù)在教科書中稱為"表觀"親和力以強(qiáng)調(diào)K d值包括潛在的親合力效應(yīng)。
[0149] 中和測(cè)定法
[0150] 使用TZM. bl細(xì)胞中基于螢光素酶的測(cè)定法評(píng)估病毒中和（J Virol79 (16) : 10108-10125)。測(cè)試的 HIV-I 假病毒主要含有 tier-2 和 tier-3 病毒 (Journal of virology 84(3) :1439-1452)(表4和 5)。在用 25μ M 幾夫喊（Enzo Life Sciences)處理的野生型細(xì)胞中（圖8C)或在HEK 293S GnTI-A細(xì)胞（圖8D)中生成僅高 甘露糖的假病毒。使用非線性回歸分析來(lái)計(jì)算觀察到半最大抑制的濃度（IC5tl值）。還使 用主要HIV-I變體（η = 95)感染用先前表征的基于PBMC的測(cè)定法評(píng)估中和活性，所述主 要HIV-I變體從具有1985和1989年之間（"歷史血清轉(zhuǎn)化者"，η = 14)或2003和2006 年之間（"當(dāng)代血清轉(zhuǎn)化者"，η = 21) (Journal of virology 85(14) :7236-7245 ;Nat Med 16(9) :995-997)的已知血清轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)的進(jìn)化枝B感染供體分離。使用GraphPad Prism軟件 (v5. Ob)以最佳擬合曲線下的面積計(jì)算每種抗體的中和活性，所述最佳擬合曲線擬合相對(duì) 于范圍為0. 001至50 μ g/ml的IC5tl值標(biāo)準(zhǔn)化的病毒比例。通過(guò)相對(duì)于最高值（用10-1074 獲得）標(biāo)準(zhǔn)化所有AUC值得到曲線下的相對(duì)面積（RAUC)值。
[0151] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0152] 用GraphPad Prism軟件（v5. Ob)實(shí)施統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)分析 針對(duì)gpl20和gpl40的抗體在針對(duì)選擇的一組9種病毒株的TZM-bl測(cè)定法中的中和效力 對(duì)表觀結(jié)合親和力。使用Mann Whitney檢驗(yàn)來(lái)比較：（i)屬于PGT121或10-1074組的抗體 對(duì)gpl20/gpl40的親和力，和（ii)針對(duì)從歷史和當(dāng)代血清轉(zhuǎn)化者分離的病毒的中和活性。
[0153] 晶化和結(jié)構(gòu)確定
[0154] 表達(dá)有6x-His標(biāo)簽的PGT121、10-1074和10-996GL Fab以進(jìn)行晶化。通過(guò)序貫 的 Ni2+-NTA 親和力（Qiagen)和 Superdex200 10/300 (GE Healthcare)大小排阻層析從經(jīng) 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK 293-6E細(xì)胞的上清液純化Fab。對(duì)于無(wú)配體PGT121 Fab的晶體，通過(guò)蛋白 A親和層析（Pierce)從經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK 293-6E細(xì)胞的上清液分離PGT121 IgG，并且通 過(guò)木瓜蛋白酶切割I(lǐng)gG以及使用Superdex200 10/300(GE Healthcare)大小排阻層析的進(jìn) 一步純化獲得Fab片段。
[0155] 將純化的Fab濃縮至PBS緩沖液中的8-20mg/mL ( "無(wú)配體" PGT121，8mg/mL ; 10-1074和GL，20mg/mL)。從蛋白質(zhì)樣品（終濃度：15mg/mL)制備"有配體"PGT121 Fab晶 體，所述蛋白質(zhì)樣品與3倍摩爾過(guò)量的NA2聚糖混合，并且于20°C溫育2小時(shí)。使用1:1蛋 白質(zhì)與儲(chǔ)器比率在400nL液滴中使用Mosquito?晶化自動(dòng)儀器（TTP labs)于20°C篩選 晶化條件。在24%PEG 4,000,0·lMTris-HClpH8·5，10mMCuCl2中獲得"無(wú)配體'^PGT121 Fab 的晶體（PSpjya = 56. 8，b = 74. 7, c = 114.9 A )，并且"有配體''PGT121 Fab 的晶 體（P212121;a = 67·8，b = 67·8，c=94·丨A)在17%PEG 10,000,0·lMBis-TrispH5·5， 0· IM CH3-COOHNh4中生長(zhǎng)。在 25% PEG 3, 350,0· IM Bis-Tris pH 5· 5,0· 2M NaCl 中獲得 10-1074Fab 的晶體（P21;a = 61. 4, b = 40. 3, c = 84.5 Α; β = 95. 39° )，并且 GL Fab 的 晶體（P21;a = 54. 9，b = 344. 7, c = 55.2 A; β = 91. 95。）在 20% PEG 3, 350,0· 24Μ 丙 二酸鈉 pH 7.0, IOmM MnCl2中生長(zhǎng)。通過(guò)在含有20%甘油（"無(wú)配體"和"有配體" PGT121 Fab)或20%乙二醇（10-1074Fab和GL Fab)的母液中浸透冷凍保護(hù)晶體，隨后在液氮中快 速冷凍。
[0156] 在6M像素檢測(cè)儀（Dectris)上在斯坦福同步福射光源（Stanford Synchrotron Radiation Lightsource，SSRL)以光束線 12-2(波長(zhǎng)=1.029 A)收集衍射數(shù)據(jù)。使 用XDS將數(shù)據(jù)索引化（index)，合并并換算（scale)。使用從"無(wú)配體" PGT121 Fab晶體 獲得的數(shù)據(jù)，我們使用Phenix在省略CDRH3和CDRL3環(huán)中的殘基后使用兩種搜索模型 PGT128Fab (PDB代碼3PV3)的Ch - Q域和2F5 (PDB代碼3IDJ)的V H - \域來(lái)尋找每個(gè)不 對(duì)稱單位的一個(gè)Fab的分子替換辦法（對(duì)于重鏈和輕鏈分別為鏈H和L)。隨后，我們使用 "無(wú)配體" PGT121結(jié)構(gòu)作為搜索模型來(lái)尋找"有配體" PGT121 Fab (每個(gè)不對(duì)稱單位的一個(gè) Fab)、10-1074Fab (每個(gè)不對(duì)稱單位的一個(gè)Fab)和GL (每個(gè)不對(duì)稱單位的四個(gè)Fab)的分子 替換辦法。
[0157] 使用Phenix并且使用Coot將模型手動(dòng)擬合到電子密度圖中來(lái)實(shí)施迭代細(xì)化（包 括GL的非結(jié)晶學(xué)對(duì)稱限制）。將原子模型細(xì)化至3.0 A分辨率（對(duì)于PGT121 Fab) 〇^作= 21.6%;%離=26.4%)，1.9人分辨率（對(duì)于1〇-1〇74卩&13)〇?工作=18.7% ;%離=22.3%)， 2.4 A.分辨率（對(duì)于4個(gè)GL Fab分子）（R工作=19. 4% ;R游離=23. 7% )，和'2.4 A.分辨率 (對(duì)于"有配體'TGTm Fab(R工作=2〇. 1%;R游離=Μ. 9% )。PGTm Fab的原子模型在拉 馬錢德蘭（Ramachandran)圖的有利（favored)、容許（allowed)和不許（disallowed)區(qū)中 分別含有 95. 2%、4· 9%和 0· 0%殘基（10-1074Fab :98· 8%，0· 9%，0· 2%;GL Fab :96· 0%， 3. 8%，0· 23% 有配體"PGT121 Fab :96· 7%，3· 1%，0· 2% )。使用 PyMOL 進(jìn)行分子顯現(xiàn)， 并且產(chǎn)生Fab結(jié)構(gòu)的圖。使用1.4 A:探針用Areaimol (CCP4Suite)實(shí)施掩埋表面積計(jì)算。
[0158] 使用PyMOL中的Super腳本比對(duì)Fab結(jié)構(gòu)。使用PDBeFold實(shí)施成對(duì)C α比對(duì)。
[0159] 實(shí)施例2 :PGT121克隆型的優(yōu)勢(shì)和多樣性
[0160] 使用YU-2 gp 140三聚物作為"誘餌"從進(jìn)化枝A感染非洲裔供體分離gp 140特異性 IgG記憶B細(xì)胞。鑒定出與23種獨(dú)特的克隆家族對(duì)應(yīng)的87種匹配的免疫球蛋白重（IgH)和 輕（IgL)鏈基因。IgH抗gpl40全集以占所有擴(kuò)充B細(xì)胞克隆的約28%的1個(gè)克隆家族占 優(yōu)勢(shì)。此B細(xì)胞家族對(duì)應(yīng)于與PGT121-123 (Nature 477(7365):466-470)相同的克隆，并且 含有38個(gè)成員，其中29個(gè)在核苷酸水平上是獨(dú)特的變體（表3)?；谄銲gH核苷酸序列， PGT121家族分成兩組：含有PGT121-123和9種緊密相關(guān)變體的PGT121樣組，和含有20個(gè) 成員的第二組10-1074樣。雖然我們的傳統(tǒng)引物（J Immunol Methods 329(1-2):112-124; Science 301 (5638):1374-1377)由于編碼框架區(qū)1的區(qū)域中的核苷酸缺失而沒(méi)有擴(kuò)增出 由PGT121B細(xì)胞克隆表達(dá)的IgL基因，使用設(shè)計(jì)為擴(kuò)增重度體細(xì)胞突變基因的新IgA特 異性引物獲得38種IgA基因中的24種（表3)。與IgH基因中的高水平超突變（平均為 18. 2%的V λ基因）一致，擴(kuò)增的IgA基因是高度突變的（平均為18. 2%的V λ基因）， 并且攜帶框架區(qū)I(FWRl)中的核苷酸缺失（12至21個(gè)核苷酸）和框架區(qū)3(FWR3)中的9 核苷酸插入（圖3B和表3)。
[0161] 圖 3(a)和 3(b)中顯示了 3 種 PGT 抗體（PGT-121，-122,和-123)，7 種 PGT121 和 10-1074 克隆變體（10-259,10-303,10-410,10-847,10-996,10-1074,10-1121，10-1130， 10-1146,10-1341，10-1369,和10-1074GM)，可能地種系（GL)，和共有序列的序列比對(duì)。下 文表1中列出了 IMGT和KABT系統(tǒng)兩者下相應(yīng)重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、重鏈⑶R、和輕鏈 CDR的序列。下文表2中列出了 KABT系統(tǒng)下序列的分配的序列標(biāo)識(shí)號(hào)：
[0162]
[0167] 11種新的獨(dú)特變體是表達(dá)的（表3)，并且通過(guò)ELISA和表面等離振子共振（SPR) 證明對(duì)YU-2 gpl20和gpl40的結(jié)合。除非另有記錄，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)用于這些和其 它實(shí)驗(yàn)的gpl20和gpl40蛋白，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞能將復(fù)合型或高甘露糖N-聚糖附著到 PNGS。與gpl20的反應(yīng)性水平在屬于PGT121和10-1074組的抗體間有所不同，后者展現(xiàn)出 更高的表觀親和力（圖3A)，這主要是由于10-1074相關(guān)抗體自gpl20/gpl40解離更慢（圖 4B) 〇
[0168] 實(shí)施例 3 :PGT121 和 10-1074 表位
[0169] V3環(huán)莖附近的Asn332gpl2(l報(bào)告為對(duì)于PGT121的結(jié)合和病毒中和是至關(guān)重要的 (Nature 477(7365) :466-470)，如此我們檢查V3在PGT121樣和10-1074樣抗體的抗原 識(shí)別中的作用。使用缺乏V1-V3環(huán)（gpl20 ttt' )或保留V3的一部分（2CC-核心）的HXB2 gpl20 "核心"蛋白，并且使用在V3莖中攜帶雙重丙氨酸取代的YU-2 gpl20突變體蛋白質(zhì) (gpl20GD324_5AA)實(shí)施ELISA。測(cè)試的抗體顯示在與完整YU-2 gpl20相比時(shí)降低的針對(duì)缺乏 V3環(huán)的變體和8ρ120-324-5ΑΑ的反應(yīng)性，其中10-1074組抗體的結(jié)合是最受影響的（圖5A和 B)。這些結(jié)果提示了這兩個(gè)抗體組的識(shí)別牽涉V3環(huán)附近的蛋白質(zhì)決定簇?？贵w無(wú)一結(jié)合 跨越V3的重疊肽，這提示了靶定表位是不連續(xù)的和/或需要通過(guò)分離的肽沒(méi)有實(shí)現(xiàn)的特定 構(gòu)象（圖5C)。
[0170] Asn332gpl2tl (以早期編號(hào)方式為 Asn337gpi2c1 (J Proteome Res7 ⑷：166〇-1674)) 是定義為序列Asn-X-Ser/Thr的潛在N-糖基化位點(diǎn)（PNGS)的N端殘基。為了測(cè)定 △811332^^和/或其N-連接的聚糖是否是新的PGT121-和10-1074-組抗體的gpl20反應(yīng) 性需要的，我們通過(guò)ELISA測(cè)試其對(duì)YU-2gpl20 N332%^結(jié)合。N332A取代降低PGT121和所有 新抗體變體的結(jié)合，而其針對(duì)缺乏鄰近糖基化位點(diǎn)的突變體g P120(gpl20?T3°HAAA突變體） 的反應(yīng)性是未變的。為了測(cè)定在AsnSSZ gpl2ciPNGS外的PNGS是否影響新抗體的識(shí)別，我們構(gòu) 建一系列的11種雙重聚糖突變體，其中YU-2 gpl20中的N332A突變是與位于Asn262gpl2Q 和AsMOegpl2tl之間的PNGS突變組合的。所有PGT121樣和10-1074樣抗體以與對(duì)gpl20 N332A 的親和力相當(dāng)?shù)挠H和力結(jié)合到每種雙重聚糖突變體。
[0171] 為了比較PGT121-和10-1074-樣抗體的總體聚糖識(shí)別，我們檢查其對(duì)用PNG酶F 處理的YU-2 gpl20的結(jié)合，所述PNG酶F切割復(fù)合型和高甘露糖N-聚糖兩者。由于gpl20 不能被完全酶促脫糖基化（除非它被變性），PNG酶F處理導(dǎo)致天然折疊的gpl20的部分脫 糖基化（圖6)。不過(guò)，兩組抗體的反應(yīng)性的差異在于PNG酶F對(duì)gpl20的部分脫糖基化降 低所有PGT121樣抗體但是無(wú)一 10-1074樣抗體的結(jié)合反應(yīng)性（圖6C)。用經(jīng)Endo H (其切 割高的甘露糖，而非復(fù)合型N-聚糖）處理的YU-2 gpl20進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)影響10-1074樣 抗體超過(guò)PGT121樣抗體的結(jié)合（圖6D)。
[0172] N-聚糖微陣列揭示了 7種測(cè)試的PGT121樣抗體中的6種顯示對(duì)以半乳糖或 α 2-6-連接的唾液酸為末端的復(fù)合型單或雙觸角N-聚糖的可檢測(cè)結(jié)合，但是對(duì)高甘露糖 型聚糖的結(jié)合檢測(cè)不到，這確證并擴(kuò)充沒(méi)有PGT121-123對(duì)高甘露糖N-聚糖的結(jié)合和Man 4 和Man9枝狀體（dendron)不競(jìng)爭(zhēng)gpl20結(jié)合的先前報(bào)告（圖7)。比較而言，10-1074樣抗 體對(duì)無(wú)蛋白質(zhì)聚糖沒(méi)有可檢測(cè)的結(jié)合（圖7)。雖然PGT121樣抗體結(jié)合無(wú)蛋白質(zhì)復(fù)合型而 非高甘露糖N-聚糖，但是PGT121樣抗體仍然結(jié)合用幾夫堿（gpl20 kif)( -種甘露糖苷酶抑 制劑，其導(dǎo)致高甘露糖聚糖專門附著至PNGS)處理的細(xì)胞中生成的YU-2 gpl20(圖8B)。大 多數(shù)PGT121樣抗體展現(xiàn)出小的，但可再現(xiàn)的結(jié)合gpl20kif的降低。相反，10-1074樣抗體仍 然完全結(jié)合gp 120kif (圖8B)。這些結(jié)果與如下的假設(shè)一致：高甘露糖及復(fù)合型N-聚糖可以 參與PGT121樣抗體的表位。
[0173] 通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA用每組的兩種代表性成員（對(duì)于PGT121樣組為PGT121和 10-1369 ;對(duì)于10-1074樣組為10-1074和10-996)實(shí)施表位定位實(shí)驗(yàn)。所有4種抗體顯 示交叉競(jìng)爭(zhēng)，但是PGT121抑制10-996和10-1074對(duì)gpl20的結(jié)合比10-996和10-1074 抑制PGT121對(duì)gpl20的結(jié)合更適度。為了進(jìn)一步定位祀定表位，我們使用抗gpl20抗 體，其識(shí)別V3環(huán)的冠（圖5)，CD4bs，共受體結(jié)合位點(diǎn)（CD4誘導(dǎo)的；CD4i)，一群高甘露 糖 N-聚糖（2G12) (Journal of virology76 (14) :7293-7305 ;Proc Natl Acad Sci USA 102 (38) : 13372-13377))，或 V3 環(huán)和位置 301 和 332 處的 N-連接的聚糖（PGT128)。抗 V3 冠抗體抑制PGT121和10-1369的結(jié)合，但是不干擾10-996和10-1074的結(jié)合。PGT128和 (在更小的程度上）2G12,而非CD4bs和CD4i抗體降低所有4種抗體對(duì)gpl20的結(jié)合。
[0174] 總之，這些數(shù)據(jù)提示了 PGT121克隆成員識(shí)別牽涉V3環(huán)和Asn332gpl2(l相關(guān)聚糖附 近的蛋白質(zhì)決定簇的位點(diǎn)。然而，克隆分成兩個(gè)家族，即PGT121樣和10-1074樣組，其差異 在于它們對(duì)gpl20的親和力及聚糖在表位形成中的作用。
[0175] 實(shí)施例4 :廣泛且有力的HIV中和
[0176] 為了評(píng)估新PGT121變體的中和活性，我們使用10種病毒株（包括R1166. cl，其缺 乏gpl20位置332處的PNGS)來(lái)測(cè)量其抑制TZM-bl細(xì)胞的HIV感染的能力。所有PGT121 變體（包括10-1074樣抗體）中和9種假病毒，并且無(wú)一中和Rl 166. cl對(duì)照（圖IA和表 4)。中和活性與對(duì)HIV刺突的親和力相關(guān)聯(lián)，其中10-1074組比PGT121組顯示略大的效 力（圖IB和圖4C)。PGT121/10-1074抗體克隆型的一種代表性種系型式（GL)不能結(jié)合 gpl20/gpl40或中和該組中的任何病毒，這暗示體細(xì)胞突變是結(jié)合和中和需要的。將GL輕 鏈與突變10-1074-或10-996-組重鏈配對(duì)不能挽救結(jié)合或中和，這提示了這兩條突變鏈促 成抗體互補(bǔ)位的正確裝配。
[0177] 實(shí)施接著的測(cè)定法以比較PGT121和兩種10-1074樣抗體（10-996和10-1074)針 對(duì)擴(kuò)充的一組119種難以中和的假病毒（分類為tier-2和tier-3)的中和活性（表4和 5)。10-996和10-1074顯示與PGT121相似的中和效力和寬度（圖1C，圖9,和表5和6)。如 預(yù)期的，大多數(shù)攜帶gpl20位置332和/或334 (跨越Asn332 - X - Ser334/Thr334 PNGS)處 的氨基酸變化的病毒對(duì)中和有抗性（83. 8%對(duì)PGT121有抗性，100%對(duì)10-1074和10-996 有抗性）。此PNGS處的突變占大多數(shù)對(duì)中和有抗性的病毒（對(duì)于10-996為68. 5%，對(duì)于 10-1074 為 72. 5%及對(duì)于 PGT121 為 60. 8% )(表 7)。對(duì) PGT121 和 10-1074 的 IgG 和 Fab 形式觀察到相當(dāng)?shù)闹泻突钚?，這提示了二價(jià)性對(duì)于其活性不是至關(guān)重要的（圖1D)。
[0178] 為了評(píng)估HIV包膜上的復(fù)合型N-聚糖在PGT121和10-1074中和中的潛在作用， 我們以兩種不同方式生成僅高甘露糖病毒體：通過(guò)在用幾夫堿處理的細(xì)胞中裝配假病毒 (這生成Man9GlcNAc2N-連接的聚糖），或者通過(guò)在HEK293S GnTI 細(xì)胞中裝配（這生成 Man5GlcNAc2N-連接的聚糖）。我們發(fā)現(xiàn)了 PGT121中和3種經(jīng)幾夫堿衍生的PGT121敏感性 /10-1074抗性株中的2種，這與其在野生型細(xì)胞中生成的對(duì)應(yīng)物等同（圖8C)。GnTryIH 胞中生成的兩種PGT121敏感性/10-1074敏感性病毒株與其在野生型細(xì)胞中生成的對(duì)應(yīng)物 同等地對(duì)PGT121和10-1074敏感。與復(fù)合型N-聚糖部分保護(hù)⑶4結(jié)合位點(diǎn)免于抗體結(jié)合 的先前報(bào)告一致，GnTI 細(xì)胞中生成的病毒對(duì)⑶4結(jié)合位點(diǎn)抗體（NIH45-46 G54lP 3BNC60) 更敏感（圖8D)。
[0179] 實(shí)施例5 :新型傳播的HIV-I
[0180