結(jié)腸癌的治療和診斷的制作方法
【專利說明】結(jié)腸癌的治療和診斷
[0001] 對相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求對2012年10月31日提交的美國臨時申請No. 61/720, 912和2013年 3月15日提交的美國臨時申請No. 61/786, 500的優(yōu)先權(quán)。這些申請的內(nèi)容通過提述完整并 入本文。
[0003] 政府利益
[0004] 本文中公開的發(fā)明至少部分在來自國家健康研宄所的撥款號I DP2 0D006506-01 下得到政府支持完成。因而，美國政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及結(jié)腸癌的的診斷和治療。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 結(jié)腸癌，常稱為結(jié)直腸癌或腸癌，是來自結(jié)腸或直腸或闌尾中不受控的細胞 生長的癌癥。參見例如，Cancer Genome Atlas Network,''Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer,''Nature 487:330 - 337 (2012 年 7月19日）。它是美國第二常見診斷的惡性和第二大常見的癌癥死亡起因。例如，患有在 早期局部化階段診斷出的結(jié)直腸癌的患者的五年存活率為92%，而如果容許癌癥擴散至臨 近器官或淋巴結(jié)則存活率降至64%，在有遠端轉(zhuǎn)移的患者中降至7%。
[0008] 結(jié)腸癌的預(yù)后與腫瘤經(jīng)由腸壁的穿透程度和節(jié)參與的存在或缺乏直接相關(guān)。因 此，早期檢測和治療是重要的。目前，診斷由用于大便潛血的篩選測定、乙狀結(jié)腸鏡檢查 (sigmoidoscopy)、結(jié)腸鏡檢查（colonoscopy)和雙重對比鋇灌腸劑的使用輔助。如由癌癥 的類型和階段決定的治療方案包括手術(shù)、放射療法和/或化療。然而，手術(shù)（最常見的治療 形式）之后的復(fù)發(fā)是一個主要問題且常是死亡的最終起因。盡管對該疾病的療法進行了研 宄，但結(jié)腸癌仍是難以診斷和治療的。如此，需要用于檢測和治療結(jié)腸癌的新藥劑和方法。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明通過提供用于診斷和治療結(jié)腸癌的藥劑和方法著手解決上述需要。
[0011] 在一個方面，本發(fā)明特征在于一種用于在有此需要的受試者中治療結(jié)腸癌（例如 轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌）的方法。該方法包括增加所述受試者中選自miR-483-5p和miR-551a的 microRNA的表達水平。增加步驟可通過對所述受試者施用編碼miR-483-5p或miR-551a的 核酸來實施。所述核酸可以是寡核苷酸，例如合成的核酸。核酸可以在載體，例如選自下組 的載體中：質(zhì)粒、病毒、粘粒、人工染色體和其他源自細菌和/或病毒源的媒介物。病毒的例 子包括腺伴隨病毒（AAV)或POX病毒。所述腺伴隨病毒或POX病毒可被修飾以提高活性、 穩(wěn)定性或特異性。在一些例子中，所述核酸含有SEQ ID NO: 1-10中任一個或其互補體的序 列。所述方法還可包括對所述受試者施用如本文中公開的另外的治療劑。
[0012] 在第二個方面，本發(fā)明提供一種分離的RNA干擾（RNAi)藥劑，其能抑制肌酸激酶 腦型（CKB)或肌酸轉(zhuǎn)運體通道SLC6a8(SLC6a8)的表達。該藥劑含有與編碼CKB或SLC6a8 蛋白的基因的區(qū)域同源或互補的第一核苷酸序列。在一些例子中，所述第一核苷酸序列包 含SEQ ID NO: 11-18中任一個的序列。
[0013] 本發(fā)明還提供一種分離的核酸，其包含編碼上述RNAi藥劑的序列的分離的核酸 和擁有該核酸的載體。所述載體可以是選自下組的載體：質(zhì)粒、病毒、粘粒、人工染色體和其 他源自細菌和/或病毒源的媒介物。優(yōu)選地，載體是病毒載體，例如AAV病毒載體。還提供 具有上述RNAi藥劑、核酸或載體的宿主細胞。另外提供一種藥物組合物，其具有（a)藥學(xué) 可接受的載體，和（b)所述RNAi藥劑、核酸或載體。所述RNAi藥劑、核酸或載體可以與其 他藥劑例如脂質(zhì)體化合物或聚乙烯胺復(fù)合用于有效投遞。在一個實施方案中，所述藥物組 合物還含有另外的治療劑。
[0014] 在第三方面，本發(fā)明特征在于一種用于在有此需要的受試者中治療癌癥如結(jié)腸 癌（例如轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌）或胰腺癌的方法。該方法包括降低所述受試者中CKB或SLC6a8) 的表達水平或活性。所述降低步驟可通過對所述受試者施用核酸、小分子化合物或兩者 來實施。在一個例子中，所述降低步驟通過對所述受試者施用環(huán)肌酸或beta-胍基丙酸 (guanidinopropionic acid)來實施。在其他例子中，降低步驟通過對所述受試者施用選自 下組的藥劑來實施：上文描述的RNAi藥劑、核酸和載體。在一些實施方案中，所述方法還包 括對所述受試者施用另外的治療劑，如beta-胍基丙酸。
[0015] 本發(fā)明特征還在于一種用于在有此需要的受試者中治療癌癥如結(jié)腸癌或胰腺癌 的方法。該方法包括通過抑制肌酸轉(zhuǎn)運體通道SLC6a8來降低所述受試者中肌酸的水平。 該方法包括對所述受試者施用beta-胍基丙酸以及任選地另外的治療劑。另外的治療劑 的例子包括選自下組的一種或多種：上文所述的環(huán)肌酸、RNAi藥劑、核酸和載體。另外的 治療劑的其他例子包括5-氟尿喃啶、奧沙利鉬（Oxaliplatin)、伊立替康（Irinotecan)、 卡培他濱（Capecitabine)、吉西他濱（Gemcitabine)、西妥昔單抗（Cetuximab)、紫杉醇 (Taxol)、阿伐斯?。ˋvastin)、亞葉酸（Ieucovorin)、Regorafenib、Zaltrap、拓撲異構(gòu)酶 I 抑制劑、NKTR-102、Tivantinib、PX-866、索拉非尼（Sorafenib)、Linifanib、激酶抑制劑、 Telatinib、XL281 (BMS-908662)、Robatumumab 和 IGFl-R 抑制劑。
[0016] 在第四方面，本發(fā)明提供一種用于確定受試者是否患有或有風(fēng)險患有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸 癌的方法。該方法包括：（i)從所述受試者獲得樣品；（ii)測量所述樣品中選自miR-483-5p 和miR-551a的microRNA的表達水平；和（ii)將該表達水平與預(yù)確定的參照值比較。如 果該表達水平低于所述預(yù)確定的參照值，則確定所述受試者患有或有風(fēng)險患有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸 癌。所述預(yù)確定的參照值可以獲自不患有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的對照受試者。樣品可以是體液樣 品或活組織檢查腫瘤樣品。該方法還可用于確定受試者是否有或有風(fēng)險具有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌 復(fù)發(fā)，或用于確定受試者是否患有或有風(fēng)險患有對化療劑或靶向療法有抗性的結(jié)腸癌或轉(zhuǎn) 移性結(jié)腸癌。更具體地，如果所述表達水平低于所述預(yù)確定的參照值，則確定所述受試者 有或有風(fēng)險具有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌復(fù)發(fā)、或?qū)焺┗虬邢虔煼ㄓ锌剐缘慕Y(jié)腸癌或轉(zhuǎn)移性結(jié)腸 癌。
[0017] 在第五方面，本發(fā)明提供一種陣列，其具有（i)具有多個獨特位置的支持物，和 (ii)具有與miR-483-5p，miR-551a或編碼CKB或SLC6a8的基因的表達產(chǎn)物（例如mRNA或 相關(guān)cDNA)互補的序列的至少一種核酸的任意組合。例如，核酸可以與SEQ ID NO: 1-18之 一互補或在嚴格雜交條件下，與SEQ ID NO: 1-18之一雜交。每個核酸被固定化于所述支持 物的獨特位置。
[0018] 本發(fā)明還提供一種用于診斷受試者中結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移潛力、轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的潛 力、轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌快速進展的潛力或轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌展現(xiàn)對化療的抗性的潛力的試劑盒。該 試劑盒包含特異性結(jié)合miR-483-5p，miR-551a或編碼CKB或SLC6a8的基因的表達產(chǎn)物（例 如mRNA，cDNA和多肽）的試劑。所述試劑可以是具有與miR-483-5p和miR-551a序列互補 的序列的探針。例如，每個探針可具有與SEQ ID NO: 1-18之一互補或在嚴格雜交條件下， 與SEQ ID NO: 1-18之一雜交的序列。試劑盒還可包含用于實施雜交測定法或PCR測定法 的試劑或上文所述的陣列。
[0019] 在第六方面，本發(fā)明提供一種鑒定可用于治療結(jié)腸癌或用于抑制癌細胞存活、缺 氧存活、轉(zhuǎn)移存活或轉(zhuǎn)移性定殖（metastatic colonization)的化合物的方法。所述方法 包括（i)獲得表達選自miR-483-5p和miR-551a的microRNA的測試細胞；（ii)將該測試 細胞暴露于測試化合物；（iii)測量測試細胞中所述microRNA的表達水平；（iv)比較該表 達水平與對照水平；和（V)如果該比較指示表達水平高于對照水平，則選擇該測試化合物 作為可用于治療結(jié)腸癌或用于抑制癌細胞存活、缺氧存活、轉(zhuǎn)移存活或轉(zhuǎn)移定殖的候選物。
[0020] 本發(fā)明還提供一種鑒定可用于治療結(jié)腸癌或用于抑制癌細胞存活、缺氧存活、轉(zhuǎn) 移存活或轉(zhuǎn)移定殖的化合物的方法。所述方法包括（i)獲得能夠表達選自CKB或SLC6a8的 基因的多肽或mRNA的測試細胞；（ii)將該測試細胞暴露于測試化合物；（iii)測量測試細 胞中所述基因的表達水平；（iv)比較該表達水平與對照水平；和（V)如果該比較指示表達 水平低于對照水平，則選擇該測試化合物作為可用于治療結(jié)腸癌或用于抑制癌細胞存活、 缺氧存活、轉(zhuǎn)移存活或轉(zhuǎn)移定殖的候選物。
[0021] 在上述方法中，對照水平可獲自與測試細胞相同的對照細胞，只不過對照細胞尚 未暴露于測試化合物。測試細胞可以是結(jié)腸癌細胞系（例如LS-174T人結(jié)腸癌系）的細 胞。在一些實施方案中，基因的表達水平可使用報道物構(gòu)建體測量，其中報道基因（例如編 碼螢光素酶、GFP或LacZ的基因）可操作地連接于編碼上述miR-483-5p，miR-551a，CKB，或 SLC6a8的基因的啟動子。
[0022] 本發(fā)明還提供一種用于在有此需要的受試者中治療乳腺癌、胃癌、胰腺癌、食道 癌、肝癌、膽囊癌、前列腺癌、肉瘤癌、黑素瘤或肺癌的方法。該方法包括對所述受試者施用 beta-胍基丙酸等。
[0023] 下文中陳述了本發(fā)明的一個或多個實施方案的詳情。本發(fā)明的其他特征、目的和 優(yōu)點從說明書和權(quán)利要求將是顯而易見的。
[0024] 附圖簡述
[0025] 圖IA-E是一組圖和照片，其顯示miR-483-5p、miR-551a和CKB是臨床相關(guān)的并且 可以被治療性抑制。a，通過定量實時PCR對37份原發(fā)性腫瘤樣品和30份肝轉(zhuǎn)移樣品中的 miR-483-5p和miR-551a水平定量。b，通過定量實時PCR對37份原發(fā)性腫瘤樣品和30份肝 轉(zhuǎn)移樣品中的CKB表達水平定量。c，注射有LvM3b細胞并在注射細胞后一天用單劑量的雙 重表達miR-483-5p和miR-551a的AAV治療的小鼠中的肝轉(zhuǎn)移。d，注射有5X 105LvM3b細胞 并每日用環(huán)肌酸治療達兩周的小鼠中肝轉(zhuǎn)移的生物發(fā)光測量。在治療結(jié)束時將小鼠安樂死 并切取肝用于離體成像。e，注射有5X 105LvM3b細胞并每日用肌酸轉(zhuǎn)運體抑制劑beta-胍 基丙酸（B-GPA)治療達兩周的小鼠中肝轉(zhuǎn)移的生物發(fā)光測量。誤差條，s.e.m;所有P值基 于單側(cè) Student' s t 檢驗。*Ρ〈0· 05 ;林Ρ〈0· 001 ;林*Ρ〈0· 0001。
[0026] 圖2是顯示B-GPA治療抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的一組圖和照片。注射有5X10sLvM3b細 胞并每日用B-GPA治療達三周的小鼠中肝轉(zhuǎn)移的生物發(fā)光測量。在三周時將小鼠安樂死并 切取肝用于生物發(fā)光成像和大體組織學(xué)（gross histology)。誤差條代表s.e.m;所有P值 基于單側(cè) Student' s t 檢驗。*Ρ〈0· 05〇
[0027] 圖3A-C是一組圖和照片，其顯示肌酸轉(zhuǎn)運體物SLC6a8是結(jié)直腸癌和胰腺癌轉(zhuǎn)移 需要的。a)表達靶向肌酸轉(zhuǎn)運體通道SLC6a8的短發(fā)夾的高度侵入性LvM3b細胞的肝轉(zhuǎn)移。 通過生物發(fā)光成像監(jiān)測肝轉(zhuǎn)移并在接種癌細胞后三周將小鼠安樂死。提取肝用于大體組織 學(xué)。b)在注射有用靶向SLC6a8的shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的5X 105SW480細胞的小鼠中的肝轉(zhuǎn)移。通 過生物發(fā)光成像監(jiān)測轉(zhuǎn)移進展。在注射后28天將小鼠安樂死并切取肝用于生物發(fā)光成像 和大體組織學(xué)。c)在注射有用靶向SLC6a8的shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的5X IO5PANCl胰腺癌細胞的小 鼠中的肝轉(zhuǎn)移。通過生物發(fā)光成像監(jiān)測轉(zhuǎn)移進展并將小鼠安樂死，如上文描述的。誤差條 代表 s. e. m ;所有 P 值基于單側(cè) Student' s t 檢驗。*Ρ〈0· 05 ;#Ρ〈(λ 001 ;*#Ρ〈(λ 0001。
[0028] 圖4是顯示與原發(fā)性腫瘤相比SLC6a8在肝轉(zhuǎn)移中上調(diào)的圖。通過定量實時PCR 對36份原發(fā)性腫瘤和30份肝轉(zhuǎn)移中SLC6a8的表達定量。誤差條代表s. e. m ;所有P值基 于單側(cè) Student' s t 檢驗。*Ρ〈0·05〇
[0029] 圖5是顯示B-GPA治療在體內(nèi)抑制肝中彌散性（disseminated) PANCl胰腺癌細胞 存活的一組圖和照片。在有和無 IOmM B-GPA預(yù)處理達48hr的情況下注射有5x105PANC1細 胞的免疫缺陷性小鼠的生物發(fā)光成像。在注射后第1天對小鼠成像并相對于第〇天將信號 標準化。P值基于單側(cè)Student' s t檢驗。*Ρ〈0· 05。
[0030] 圖6是顯示B-GPA增強吉西他濱對PANCl胰腺癌細胞的細胞毒性的圖。在用逐步 升高劑量的僅吉西他濱或逐步升高劑量的吉西他濱與IOmM B-GPA組合治療后PANCl胰腺 癌細胞的細胞存活力。使用WST-I試劑測定細胞存活力。誤差條代表均值的標準誤差。
[0031] 圖7是顯示B-GPA增強5'-氟尿嘧啶對LS-LvM3b結(jié)直腸癌細胞的細胞毒性的圖。 在用逐步升高劑量的僅5' -氟尿嘧啶或逐步升高劑量的5' -氟尿嘧啶與IOmM B-GPA組合 治療后Ls-LvM3b細胞的細胞存活力。使用WST-I試劑測定細胞存活力。誤差條代表均值 的標準誤差。
[0032] 發(fā)明詳述
[0033] 本發(fā)明至少部分基于以下預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)，即協(xié)同性miRNA-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)在轉(zhuǎn)移 性結(jié)腸癌的肝定殖中失調(diào)，且miRNA(例如miR-483_5p和miR_551a)通過協(xié)同性革El向腦肌 酸激酶依賴性能量學(xué)來抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移性存活。因此，本發(fā)明提供用于診斷和治療結(jié)腸癌， 特別是轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的新藥劑和方法。
[0034] 彌散性癌細胞對器官的定殖代表癌癥進展的最終、臨床上最重大的和了解最少的 階段。肝是許多癌癥類型的這類轉(zhuǎn)移性定殖的高度常見器官。為了了解肝定殖的分子基礎(chǔ)， 建立了結(jié)腸癌的肝定殖的體內(nèi)選擇模型。由于它將競爭性器官內(nèi)體內(nèi)選擇與小RNA序型分 析（profiling)偶聯(lián)以平行地功能性評估611種microRNA在肝定殖期間的體內(nèi)作用，因此 它是一種強大的系統(tǒng)。如本文中公開的，內(nèi)源性miR-483-5p和miR-551a被鑒定為許多突 變背景的多種結(jié)腸癌群體中肝轉(zhuǎn)移性定殖的有力抑制劑。這些miRNA在轉(zhuǎn)移性細胞中和人 肝轉(zhuǎn)移中是表觀遺傳沉默的，而且通過靶向腦型肌酸激酶（CKB)來抑制轉(zhuǎn)移。
[0035] 如本文中公開的，CKB通過增強彌散性癌細胞在肝（在該處其遇到肝缺氧）中的 存活來促進轉(zhuǎn)移。結(jié)腸癌存活依賴于磷酸肌酸的CKB產(chǎn)生，磷酸肌酸充當(dāng)用于生成忍耐肝 缺氧所需的ATP的能量庫。與此一致，經(jīng)由肌酸轉(zhuǎn)運體敲低來抑制癌細胞肌酸攝取也減少 轉(zhuǎn)移。經(jīng)由腺伴隨病毒投遞治療性施用miR-483-5p和miR-551急劇抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。另 外，用小分子抑制劑治療性靶向CKB顯著抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果突顯了代謝能量學(xué)在 癌癥進展期間在維持轉(zhuǎn)移性存活中的重要性。本文中公開的發(fā)現(xiàn)對于治療優(yōu)先定殖到肝且 每年索取超過500, OOO人的生命的胃腸惡性具有重要的啟示。而且，本文中公開的體內(nèi)篩 選/選擇辦法有全面和快速鑒定調(diào)控任何癌癥類型對任何器官的定殖的編碼和非編碼基 因的潛力。
[0036] 如本文中公開的，經(jīng)由上文所述的辦法，一組miRNA被鑒定為在人轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌系 中失調(diào)（deregulated)。如本文中公開的，miR-483_5p和miR-551a充當(dāng)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的有力 內(nèi)源抑制劑，其經(jīng)由會聚性靶向代謝基因肌酸激酶腦型（CKB)實現(xiàn)。這些miRNA在鑒定形 成結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)的患者中展現(xiàn)出重要的預(yù)后能力，而治療性投遞這些miRNA則顯著抑 制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。
[0037] 本文中公開的miRNA-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的成員可用作用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的靶物。 另外，該成員可用作生物標志物，用于確定受試者是否患有或有風(fēng)險患有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌，或 用于確定患有該病癥的患者的預(yù)后或監(jiān)測。因此，本發(fā)明涵蓋通過靶向一個或多個所述成 員治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的方法，確定用于抑制癌癥的治療方案的功效的方法，和鑒定抗癌劑 的方法。還提供診斷受試者是否患有或有風(fēng)險患有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的方法，和篩選出認為有 風(fēng)險形成該病癥的受試者的方法。本發(fā)明還涵蓋適用于實施上述方法的各種試劑盒。
[0038] 治療方法
[0039] 如本文中公開的，miR-483-5p和miR-551a被鑒定為結(jié)腸癌和其他癌癥類型中的 癌細胞存活、缺氧存活、轉(zhuǎn)移性存活、或轉(zhuǎn)移性定殖的內(nèi)源性轉(zhuǎn)移抑制劑，而CKB和肌酸運 輸通道SLC6a8發(fā)揮同一過程的轉(zhuǎn)移促進物作用。這些miRNA或蛋白質(zhì)不僅強烈預(yù)測人轉(zhuǎn) 移結(jié)果，而且還提供用于治療癌癥如結(jié)腸癌和其他癌癥類型的靶物。
[0040] 因此，本發(fā)明提供在治療癌癥如結(jié)腸癌和其他癌癥類型中使用相關(guān)藥劑（包括 microRNA、靶向CKB的RNAi藥劑、靶向SLC6a8的RNAi藥劑、編碼這類RNAi藥劑的載體（例 如AAV)、環(huán)肌酸和胍基丙酸）的方法，其經(jīng)由增加所述受試者中一種或多種轉(zhuǎn)移抑制劑的 表達水平或活性水平進行。該增加可通過迫使一種或多種轉(zhuǎn)移抑制劑表達等來實現(xiàn)。另 外，治療可通過降低一種或多種轉(zhuǎn)移促進物的表達水平或活性水平來實現(xiàn)。其他癌癥類型 的例子包括實體腫瘤，特別是癌。例示性實體腫瘤包括但不限于，肺癌、乳腺癌、骨癌、卵巢 癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、精巢癌、肝癌、腮腺癌、膽管癌、結(jié)腸癌、直腸癌、宮頸癌、子 宮癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、甲狀腺癌、鱗狀細胞癌、腺癌、小細胞癌、間皮瘤 黑素瘤、骨髓瘤、淋巴瘤神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、卡波西肉瘤、和肉瘤。具 體地，本發(fā)明的方法可用于治療胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、膽管癌和乳腺癌。
[0041] 轉(zhuǎn)移抑制劑的強迫表達
[0042] miR-483-5p和miR-551a兩者和編碼它們的核酸均可用作轉(zhuǎn)移抑制劑，從而通過 在目的細胞或有此需要的受試者中將其過表達來實施本發(fā)明。
[0043] "過表達"指由導(dǎo)入宿主細胞的核酸所編碼的RNA或多肽的表達，其中該RNA或多 肽或蛋白質(zhì)或者正常不存在于該宿主細胞中，或者其中該RN