超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物及其制備方法
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物及其制備方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]佐劑是疫苗的重要組成部分，缺乏佐劑，絕大多數(shù)蛋白抗原很難引起機體強有力的免疫反應(yīng)。目前應(yīng)用于人體的佐劑主要是鋁佐劑及MF59佐劑，但這兩種佐劑難以引起機體強有力的細(xì)胞免疫反應(yīng)即殺傷性免疫反應(yīng)。
[0003]金納米粒子因為制備方法簡單、穩(wěn)定、生物相容性好等特點在生物上有廣泛的應(yīng)用。目前已經(jīng)有關(guān)于金納米粒子用于增強機體免疫反應(yīng)的研究報道。金納米粒子與蛋白復(fù)合物應(yīng)用于免疫反應(yīng)主要是增強機體的體液免疫反應(yīng)即抗體反應(yīng)；且由于金納米粒子負(fù)載蛋白抗原的能力較低，如果需要提高金納米粒子對蛋白抗原的負(fù)載能力，需要對蛋白抗原進(jìn)行修飾(如巰基化)，這限制了金納米粒子在機體免疫方面的應(yīng)用。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]為了克服現(xiàn)有的金納米粒子在蛋白抗原負(fù)載及引起細(xì)胞殺傷性免疫反應(yīng)不足等缺點，本發(fā)明的首要目的在于提供一種超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供由上述制備方法得到的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物，以作為一種新型的佐劑，增強機體的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):一種超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟:
[0007](I)將濃硫酸和硝酸按體積比10:1-1:1混合后加入石墨，均勻分散后于80_150°C加熱攪拌5min-24h，冷卻至室溫后加水稀釋，調(diào)節(jié)pH值至中性，過濾，取濾液透析，得到超小氧化石墨烯；每毫升硝酸加入1-1OOOmg石墨；
[0008](2)將水加入步驟(I)的超小氧化石墨烯中，然后加入氯金酸溶液，0_60°C攪拌5min-24h后透析，得到超小氧化石墨烯-金納米粒子復(fù)合材料；每一毫克超小氧化石墨烯加入1-1OOml水，水與氯金酸溶液的體積比為20:1-200:1 ;氯金酸溶液與超小氧化石墨烯的質(zhì)量比為0.1-100:1 ；
[0009](3)將步驟(2)的超小氧化石墨烯-金納米粒子復(fù)合材料與蛋白抗原按體積比1:3-10:3混合，室溫震蕩過夜后離心，取沉淀，除去雜質(zhì)，得到超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物；所述的超小氧化石墨烯-金納米粒子復(fù)合材料與卵清蛋白的濃度比為1:2-2:1。
[0010]步驟(I)中:
[0011]所述的均勻分散優(yōu)選為室溫水浴超聲l-15min ；
[0012]所述的pH值調(diào)節(jié)優(yōu)選采用碳酸氫鈉進(jìn)行調(diào)節(jié)；
[0013]所述的過濾優(yōu)選采用濾紙進(jìn)行過濾；
[0014]所述的透析優(yōu)選為于截留分子量1000-10，OOODa的透析袋中透析48h ；
[0015]所述的超小氧化石墨烯的直徑優(yōu)選為3_5nm ；
[0016]所述的硝酸優(yōu)選為發(fā)煙硝酸或硝酸；
[0017]透析得到的超小氧化石墨烯的濃度較低，可以利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于70°C進(jìn)行水浴濃縮，得到黃褐色的超小氧化石墨烯。
[0018]步驟(2)中:
[0019]所述的透析優(yōu)選為于截留分子量1000-100，OOODa的透析袋中透析24h ；
[0020]所述的氯金酸溶液優(yōu)選為10mg/mL的氯金酸溶液；
[0021]透析得到的超小氧化石墨烯-金納米粒子復(fù)合材料的濃度較低，可以利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于70°C進(jìn)行水浴濃縮，得到濃度較高的超小氧化石墨烯-金納米粒子復(fù)合材料。
[0022]步驟(3)中:
[0023]所述的離心優(yōu)選為于4000rpm、4°C離心1min ；
[0024]所述的除去雜質(zhì)優(yōu)選采用以下步驟進(jìn)行:將沉淀加水或PBS進(jìn)行重懸，離心洗滌后再加水或PBS進(jìn)行重懸，得到超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物；
[0025]所述的離心洗滌優(yōu)選為于12000rpm離心洗滌兩次；
[0026]所述的水均為純凈水。
[0027]所述的蛋白抗原優(yōu)選為病毒性外殼蛋白或腫瘤細(xì)胞表面特異性蛋白抗原。
[0028]一種超小氧化石墨烯-金納米粒子復(fù)合物，由上述制備方法得到。
[0029]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點和有益效果:
[0030](I)本發(fā)明通過濃硫酸和硝酸氧化石墨得到超小氧化石墨烯，其制備方法簡單，成本低，產(chǎn)率高，達(dá)60%，得到的超小氧化石墨烯粒徑均一，為3-5nm，可以在培養(yǎng)基和鹽溶液中穩(wěn)定存在，保證了可以作為佐劑的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物的生物學(xué)效應(yīng)的穩(wěn)定性，這對于保證疫苗的穩(wěn)定是很重要的。
[0031](2)本發(fā)明利用超小氧化石墨烯分子自身的還原性，還原氯金酸，原位合成金納米粒子，形成超小氧化石墨烯-金納米粒子復(fù)合材料；超小氧化石墨烯-金納米粒子復(fù)合材料通過π-π堆垛、疏水相互作用、靜電作用及形成Au-S鍵等方式負(fù)載蛋白抗原，得到超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物。該制備方法簡單，價格低廉，所采用的超小氧化石墨烯-金納米粒子具有良好的生物相容性，能極大的提高金納米粒子對蛋白抗原的負(fù)載效率，并提高了機體對蛋白抗原的免疫反應(yīng)效果，尤其是細(xì)胞免疫反應(yīng)效果。
【【附圖說明】】
[0032]圖1是實施例1的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物的合成示意圖；
[0033]圖2是實施例1的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物的透射電鏡照片；
[0034]圖3是實施例1的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物的紫外可見吸收光譜圖；
[0035]圖4是實施例1的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物激發(fā)小鼠體液免疫反應(yīng)性能示意圖；
[0036]圖5是實施例1的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物激發(fā)小鼠細(xì)胞免疫反應(yīng)流式細(xì)胞分析圖；
[0037]圖6是效果實施例的超小氧化石墨的透射電鏡照片；
[0038]圖7是效果實施例的超小氧化石墨烯在純水和PBS中分散性能的對比結(jié)果圖?！尽揪唧w實施方式】】
[0039]下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0040]實施例1
[0041](I)超小氧化石墨烯的制備:
[0042]將15mL濃硫酸和5mL發(fā)煙硝酸混合，然后加入0.2g石墨，混合均勻后水浴室溫超聲1min,然后于120°C攪拌30min,冷卻至室溫后加入10mL水稀釋,并用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH值到中性；采用濾紙過濾后，將溶液裝入透析袋(截留分子量SOOODa)中，在水中透析48h(去除溶液中的鹽)，透析后的溶液即為超小氧化石墨烯，此時制備得到的超小氧化石墨烯濃度較低，采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、于70°C進(jìn)行水浴濃縮，得到黃褐色超小氧化石墨烯。
[0043](2)超小氧化石墨烯-金納米粒子復(fù)合材料的制備:
[0044]將3mg步驟(I)的超小氧化石墨烯加水稀釋至30ml,然后加入150 μ L、10mg/L的氯金酸溶液，混合后室溫攪拌40-45min后，用水透析(透析袋截留分子量50，OOODa) 24h以去除沒有反應(yīng)的氯金酸，得到超小氧化石墨烯-金納米粒子復(fù)合材料；此時制備得到的超小氧化石墨烯-金納米粒子復(fù)合材料濃度較低，可采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、于70°C進(jìn)行水浴濃縮。
[0045](3)超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物的制備及應(yīng)用:
[0046]取5mll.5mg/mL步驟(2)制備的超小氧化石墨-金納米粒子復(fù)合材料與3mLlmg/mL的卵清蛋白(OVA)混合，室溫下震蕩過夜后4000rpm、4°C離心lOmin，取沉淀用600 μ L水重懸，12000rpm離心洗漆兩次,再用600 μ L水重懸,得到超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物(即“超小氧化石墨烯-金納米粒子OOVA”)。
[0047]取上述超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物進(jìn)行透射電鏡實驗；結(jié)果如圖2所示，從圖2可以看出，在超小氧化石墨烯上原位合成了 5-10nm的金納米粒子。超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復(fù)合物的紫外吸收光譜如圖3所示，從圖3可以看出，蛋白抗原已經(jīng)成功負(fù)載在了超小氧化石墨-金納米粒子復(fù)合材料的表面。
[0048]以C57BL/6小鼠為模型，比較了 OVA、鋁佐劑與OVA混合物、超小氧化石墨烯-金納米粒子@ova引起的小鼠體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)性能。
[0049]將上述材料按每只小鼠50 μ g(按OVA的量計算)終體積100 μ L材料皮下注射免疫小鼠，一周免疫一次，共免疫三次。然后在第一次免疫后第21天摘除眼球取血處死小鼠,收集血清及脾臟細(xì)胞。血清用于檢測小鼠產(chǎn)生的抗OVA抗體。與OVA及鋁佐劑OVA混合物的免疫活性相比，在免疫21天后，超小氧化石墨烯-金納米粒子@0VA能提高小鼠產(chǎn)生抗OVA抗體的能力，結(jié)果如圖4所示。將脾臟細(xì)胞按I X 16/孔的量種植于48孔板中，然后與終濃度為10 μ g/mL的OVA孵育66h后，收集脾臟細(xì)胞，利用ant1-CD3e_PE及ant1-CD4_FITC抗體染色，檢測脾臟細(xì)胞中OVA特異性⑶4+T所占的比例。利用ant1-⑶3e-PE及ant1-⑶8a_FITC抗體染色，檢測脾臟細(xì)胞中OVA特異性CD8+T所占的比例。與鋁佐劑OVA混合物的免疫活性相比，超小氧化石墨烯-金納米粒子OOVA不但促進(jìn)小鼠的抗原特異性CD4+T免疫反應(yīng)，還能提高機體的CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)即機體的殺傷性免疫反應(yīng),結(jié)果如圖5所示。
[0050]實施例2
[0051](I)超小氧化石墨烯的制備:同實施例1的步驟(I)；
[0052](2)超小氧化石墨烯-金納米粒子復(fù)合材料的制備:同實施例1的步驟(2)；
[0053](