受體激動(dòng)劑的制作方法
【專利說明】神經(jīng)保護(hù)性CB2受體激動(dòng)劑 延續(xù)申請(qǐng)信息
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年7月13日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)第61/671，277號(hào)的權(quán)益，其公 開內(nèi)容通過引用并入本文中。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默氏病（AD)是年齡相關(guān)性神經(jīng)變性病癥，其特征在于記憶和認(rèn)知功能 的逐漸喪失。AD患者的腦的特征在于淀粉樣β (A β)肽的細(xì)胞外聚集的大量沉積物。 這些肽形成老年斑和過度磷酸化tau蛋白的細(xì)胞內(nèi)聚集。淀粉樣纖維的異常積聚導(dǎo)致神 經(jīng)元回路逐漸喪失、腦中的突觸可塑性受損和最終記憶缺陷。另外，淀粉樣纖維激活炎癥 路徑，其特征在于，在AD患者的腦中看到激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞。可能的情況是， 神經(jīng)炎癥可誘導(dǎo)有益的免疫反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)淀粉樣纖維的吞噬，以試圖限制疾病的發(fā)展。 Wyss-Coray, ，Nat. Med 12, 1005-1015 (2006)。然而，最普遍的證據(jù)表明，神經(jīng)炎癥可能是 通過由腦中的激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞產(chǎn)生促炎趨化因子、細(xì)胞因子和神經(jīng)毒素加速 AD 的驅(qū)動(dòng)力。Perry 等人，Nat. Rev. Neurol. 6, 193_2〇1 (2〇10) 〇
[0003] 大麻素受體（CB)家族目前包括兩種克隆的促代謝受體：CB1(主要在腦中發(fā)現(xiàn)）和 CB2(主要在外周免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，并且較少地在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)）。向 大鼠腦海馬中體內(nèi)注射A ^_42導(dǎo)致內(nèi)源性大麻素水平的增加 （van der Stelt等人，Cell. Mol. Life Sci. 63, 1410-1424 (2006))，并且花生四烯酸乙醇胺已被證明可防止細(xì)胞培養(yǎng)物 中的 A β 毒性（Milton, Neurosci. Lett. 332, 127-130(2002))。
[0004] 除了位于腦干和小腦中的小群體神經(jīng)元以外，健康的腦組織不表達(dá)CB2受體。 Van Sickle 等人，Science 310,329-332(2005)。相反，CB2 受體在 AD、亨廷頓氏病、猿 免疫缺陷病毒誘導(dǎo)的腦炎、HIV腦炎和多發(fā)性硬化中在反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)。體外 研宄表明，〇8 2選擇性激動(dòng)劑阻斷在將A β加入大鼠皮層共培養(yǎng)物中后小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo) 的神經(jīng)毒性。此外，向大鼠腦室內(nèi)給藥非選擇性大麻素受體激動(dòng)劑WIN 55, 212-2防止 A β誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活、認(rèn)知損害和神經(jīng)元標(biāo)記的喪失。CB2激動(dòng)劑是神經(jīng)保護(hù)性 的，并且它們具有沒有用〇8 1激動(dòng)劑時(shí)通?？吹降木癫涣甲饔玫膬?yōu)點(diǎn)。Ramirez等人， J. Neurosci. 25, 1904-1913(2005)。相反，081激動(dòng)劑在AD小鼠模型中似乎對(duì)AD神經(jīng)病理 學(xué)和行為缺陷沒有有益的效果。Chen等人，Curr. Alzheimer Res. 7, 255-261 (2010)。
[0005] 研宄表明，在AD背景中，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞變成完全反應(yīng)性的，從而引發(fā)導(dǎo) 致潛在神經(jīng)毒性物質(zhì)（包括細(xì)胞因子）的釋放的促炎級(jí)聯(lián)，所述潛在神經(jīng)毒性物質(zhì)導(dǎo)致神 經(jīng)元的變性改變。CB 2在這個(gè)過程中也上調(diào)。本發(fā)明人以前的工作確立1-((3-芐基-3-甲 基-2, 3-二氫-1-苯并呋喃-6-基）羰基）哌啶（MDA7)為新的血腦屏障滲透劑和高度選 擇性 082激動(dòng)劑。Diaz 等人，Che_edchem 4,1615-1629(2009)。MDA7 在 CB2基因敲除小鼠 中缺乏活性，并且其在大鼠和C57BL/6野生型小鼠中的效果受CB2拮抗劑拮抗。Naguib等 人，Anesth. Analg. 114, 1104-1120(2012)。在體內(nèi)和體外模型中，MDA7的神經(jīng)保護(hù)效果被 發(fā)現(xiàn)是通過防止膠質(zhì)細(xì)胞激活來介導(dǎo)。MDA7在其它膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)性病理生理學(xué)病癥（例如 AD)中的潛在效果仍未探討。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 大麻素2型（CB2)激動(dòng)劑是神經(jīng)保護(hù)性的，并且似乎在阿爾茨海默氏病的神經(jīng)變 性過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明人研宄了 MDA7(新的缺乏精神活性的選擇性CB2激動(dòng)劑） 改善通過向大鼠的海馬CAl區(qū)中雙側(cè)微量注射淀粉樣β (A β Htl)纖維誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥過 程、突觸功能障礙和認(rèn)知損害的效果。在注射A β Htl纖維的大鼠中，與腹膜內(nèi)（i. ρ.)給藥 鹽水持續(xù)14天相比，每天用15mg/kgMDA7i.p.治療持續(xù)14天（i)改善⑶Ilb (小膠質(zhì)細(xì)胞 標(biāo)記）和GFAP(星形細(xì)胞標(biāo)記）的表達(dá)，（ii)減少IL-I β的分泌，（iii)降低CB2受體的 高漲，（iv)促進(jìn)A β的清除，以及（V)恢復(fù)突觸可塑性、認(rèn)知和記憶。研宄結(jié)果表明，MDA7 是用于治療阿爾茨海默氏病的創(chuàng)新治療方法。
[0007] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供通過向個(gè)體給藥藥學(xué)有效量的CB2受體激動(dòng)劑治療或 預(yù)防所述個(gè)體的神經(jīng)炎癥和/或神經(jīng)變性疾病的方法。在一些實(shí)施方案中，所述CB 2受體 激動(dòng)劑包含式I的化合物：
或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中=R1選自環(huán)烷基或雜環(huán)烷基，其任何碳原子均可任選地被 取代；并且R2選自芳基、環(huán)烷基、芳烷基和烯基，其任何碳原子均可任選地被取代。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供通過向個(gè)體給藥藥學(xué)有效量的CB2受體激動(dòng)劑激活所述 個(gè)體的小膠質(zhì)細(xì)胞中的CB 2受體的方法。在一些實(shí)施方案中，所述個(gè)體的腦中的淀粉樣β 肽的水平升高。在其它實(shí)施方案中，激活所述CB2受體增加所述個(gè)體的突觸可塑性、認(rèn)知 或記憶中的一種或多種。在另外的實(shí)施方案中，激活所述CB 2受體減少由小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生 IL-I β并且抑制MAPK。在再一實(shí)施方案中，激活所述CB2受體增加所述個(gè)體中的谷氨酸能 神經(jīng)傳遞。 圖式簡(jiǎn)單說明
[0009] 圖1提供柱狀圖，其示出給藥MDA7在Morris水迷宮測(cè)試中減弱淀粉樣纖維損害 的表現(xiàn)。（A)MDA7治療以劑量依賴性方式降低Morris水迷宮測(cè)試中的逃脫等待時(shí)間評(píng)分。 注射淀粉樣（A β ) A β 維并用15mg/kg MDA7腹膜內(nèi)（i. p.)治療14天的動(dòng)物與注射 A β Htl纖維并用鹽水i. p.治療14天的動(dòng)物相比，在Morris水迷宮測(cè)試中在第3天和第 5天具有顯著（P〈0. 05)更短的逃脫等待時(shí)間。相比之下，1.5mg/kg MDA7i.p.持續(xù)14天在 A 纖維給藥后未實(shí)現(xiàn)任何顯著的記憶增強(qiáng)，然而，5mg/kg MDA7劑量的效果僅限于第 3天和第5天。（B)在第6天進(jìn)行探索試驗(yàn)以測(cè)定與右象限（RQ)、相對(duì)象限（OQ)和左象限 (LQ)相比在目標(biāo)象限（TQ或平臺(tái)象限）中所度過的時(shí)間。注射A自^纖維并用15mg/kg MDA7i. p.治療14天的大鼠與注射A β ^^并用鹽水i. p.治療14天的動(dòng)物相比在TQ中度 過最長時(shí)間（P〈〇. 05)。（C)注射A β Htl纖維并用鹽水i. p.治療14天的大鼠與接受雙側(cè) 腦內(nèi)微量注射人造腦脊液并用鹽水i.P.治療的大鼠（對(duì)照）或注射A 并用15mg/kg MDA7i. p.治療14天的動(dòng)物相比在Morris水迷宮測(cè)試中在第3-5天具有顯著延長的逃脫等 待時(shí)間。在MDA7治療之前給藥AM630消除了所觀察到的MDA7的效果，這表明MDA7的效果 通過刺激大麻素（〇3) 2受體介導(dǎo)。此外，注射A β Htl并僅i.p.接受5mg/kg AM63014天的 大鼠與注射A β卜^并用鹽水i. p.治療或用5mg/kg AM630加上15mg/kg MDA7i. p.治療14 天的動(dòng)物相比具有類似的認(rèn)知損害。接受雙側(cè)腦內(nèi)微量注射人造腦脊液并用鹽水i.P.或 15mg/kg MDA7治療14天的大鼠的逃脫等待時(shí)間值未表現(xiàn)出顯著差異。（D)在探索試驗(yàn)期 間，注射人01_ 4(|纖維并用1511^/1^1〇^7;[^.治療14天的大鼠與注射人01_4(|并用鹽水 i. P.、單獨(dú)AM630或AM630加上MDA7治療14天的動(dòng)物相比在TQ中度過最長時(shí)間（P〈0. 01)。 統(tǒng)計(jì)顯著性通過方差的重復(fù)測(cè)量分析及隨后Student-Newman-Keuls多范圍檢驗(yàn)來確定。
[0010] 圖2提供的圖形和圖像示出給藥MDA7減弱海馬CAl區(qū)中淀粉樣纖維誘導(dǎo)的CDllb 免疫反應(yīng)性。（A)示出海馬墨水注射的大鼠冠狀腦切片：注射印度墨水，以確認(rèn)注射操作 是準(zhǔn)確的，并且材料被明確注射到大鼠的海馬CAl區(qū)中。（B)各組大鼠中海馬CAl區(qū)中的 CDllb免疫反應(yīng)性的免疫熒光圖像。（C)CDllb免疫熒光強(qiáng)度的分析（來自每組5只動(dòng)物的 20個(gè)切片）表明，接受為期14天的MDA7腹膜內(nèi)（i. p.)治療的注射淀粉樣β (A β夂^的 大鼠與注射A ^^并用鹽水i.p.治療14天的動(dòng)物相比免疫熒光強(qiáng)度顯著較低（Ρ〈0.01)。 (D)海馬CAl區(qū)中的⑶Ilb反應(yīng)性的免疫印跡。（E)⑶Ilb免疫反應(yīng)性的分析表明，注射 A β ^并用鹽水i. ρ.治療14天的動(dòng)物中的⑶Ilb強(qiáng)度與對(duì)照組（每組η = 5-7)相比顯 著增加（Ρ〈〇. 01)。這些變化在接受為期14天的MDA7i. ρ.治療的注射A β Htl的大鼠中顯 著減弱（Ρ〈〇. 01)。應(yīng)注意，單獨(dú)用MDA7治療與對(duì)照大鼠相比對(duì)⑶Ilb的表達(dá)無顯著效果。 統(tǒng)計(jì)顯著性通過單向方差分析及隨后Student-Newman-Keuls多范圍檢驗(yàn)來確定。
[0011] 圖3提供的圖形和圖像示出給藥MDA7減弱海馬CAl區(qū)中淀粉樣纖維誘導(dǎo)的膠質(zhì) 纖維酸性蛋白（GFAP)免疫反應(yīng)性。（A)各組大鼠中海馬CAl區(qū)中的GFAP免疫反應(yīng)性的免 疫熒光圖像。（B)GFAP免疫熒光強(qiáng)度的分析（來自每組5只動(dòng)物的20個(gè)切片）表明，接受 為期14天的15mg/kg MDA7腹膜內(nèi)（i.p.)治療的注射淀粉樣β (A ^p4ci的大鼠與注射 A β ^^并用鹽水i. ρ.治療14天的動(dòng)物相比免疫熒光強(qiáng)度顯著較低（Ρ〈0. 01)。（C)海馬 CAl區(qū)中的GFAP反應(yīng)性的免疫印跡。（D) GFAP免疫反應(yīng)性的分析表明，注射A β Htl并用鹽 水i. Ρ.治療14天的大鼠中的GFAP強(qiáng)度與對(duì)照組（每組η = 5-7)相比顯著增加（Ρ〈0. 01)。 這些變化在接受為期14天的MDA7i. ρ.治療的注射A β Htl的大鼠中顯著減弱（Ρ〈〇. 01)。 應(yīng)注意，單獨(dú)用15mg/kg MDA7i.p.治療與對(duì)照大鼠相比對(duì)GFAP的表達(dá)無顯著效果。統(tǒng)計(jì) 顯著性通過單向方差分析隨后Student-Newman-Keuls多范圍檢驗(yàn)來確定。
[0012] 圖4提供的圖形和圖像示出給藥MDA7減弱海馬CAl區(qū)中A β _纖維上調(diào)的大 麻素（CB)2受體的表達(dá)。（A)海馬CAl區(qū)中的CB2染色和定位。示出了小膠質(zhì)細(xì)胞中CB 2* CDllb的免疫熒光圖像以及CB2和小膠質(zhì)細(xì)胞的共區(qū)域化。（B)在對(duì)照組中未觀察到明顯的 CB2表達(dá)，但在注射A β ^^并用鹽水腹膜內(nèi)（i.p.)治療14天的大鼠中觀察到明顯的082表 達(dá)（相對(duì)于對(duì)照，P〈〇. 01)(來自每組5只動(dòng)物的η = 20個(gè)切片）。在接受為期14天的15mg/ kgMDA7i.p.治療的注射A β ^^的大鼠中CB2的表達(dá)顯著降低。（C)代表性免疫印跡條帶， 其示出所有組中海馬CAl區(qū)中的CB 2受體的表達(dá)；(D)所有組中海馬CAl組織中的CB 2免疫 反應(yīng)性的圖形分析（繪圖分析？）。應(yīng)注意，MDA7治療顯著逆轉(zhuǎn)由A β Htl誘導(dǎo)的CB 2表達(dá) 的高漲（Ρ〈〇. 01);每組η = 6。統(tǒng)計(jì)顯著性通過單向方差分析隨后Student-Newman-Keuls 多范圍檢驗(yàn)來確定。數(shù)據(jù)顯示為平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。比例尺=40 μπι。
[0013] 圖5提供的圖形和圖像示出給藥MDA7降低海馬CAl區(qū)中淀粉樣β (Α 纖維 上調(diào)的白細(xì)胞介素 （I L)-1 β的水平。（A)所有組中海馬CAl組織中的IL-I β反應(yīng)性的免 疫印跡；(B)所有組中海馬CAl組織中的IL-I β免疫反應(yīng)性的圖形分析。應(yīng)注意，為期14 天的15mg/kg MDA7腹膜內(nèi)（i. ρ.)治療顯著逆轉(zhuǎn)由A β _誘導(dǎo)的IL-I β蛋白表達(dá)的增加 (P〈0. 01 ;每組η = 5 ;單向方差分析隨后Student-Newman-Keuls多范圍檢驗(yàn)）。數(shù)據(jù)顯示 為平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0014] 圖6提供的圖形和圖像示出大麻素（CB)2激動(dòng)劑MDA7誘導(dǎo)淀粉樣β (Α β ) Htl 的清除。（A)不同組中海馬CAl區(qū)中的A β Htl沉積物的免疫熒光圖像。（B)注射A β 并用15mg/kg MDA7腹膜內(nèi)（i. p.)治療14天的大鼠表現(xiàn)出沉積A β肽的減少（相對(duì)于 注射A 并用鹽水i.p.治療14天的大鼠，P〈0. 01 ;來自每組5只動(dòng)物的η = 20個(gè) 切片），并且該效果通過預(yù)先i.p.給藥5mg/kg ΑΜ630持續(xù)14天而消除。單獨(dú)i.p.給 藥511^/1^4163〇對(duì)注射的人01_4(|的清除無效果。統(tǒng)計(jì)顯著性通過單向方差分析隨后 Student-Newman-Keuls多范圍檢驗(yàn)來確定。數(shù)據(jù)顯示為平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。比 例尺=80 μπι。
[0015] 圖7提供的圖形示出為期14天的腹膜內(nèi)（i. ρ.)系統(tǒng)給藥15mg/kgMDA7改善海馬 CAl切片中的淀粉樣β (A ^p4tl損害的基底谷氨酸能強(qiáng)度和長時(shí)程增強(qiáng)（LTP)。LTP通過 以IOOHz對(duì)Schaffer側(cè)副-連合纖維電刺激1秒誘導(dǎo)。（A)所有組中在3個(gè)等級(jí)的刺激強(qiáng) 度下誘發(fā)的興奮性突觸后電流（EPSC)的代表性軌跡。（B)所有4個(gè)組中CAl神經(jīng)元（每組 η = 9-10個(gè)神經(jīng)元）中的誘發(fā)的EPSC的輸入（刺激強(qiáng)度）-輸出（EPSC電流）曲線。（C) 示出所有4個(gè)組中在基線、電感應(yīng)后30分鐘和60分鐘誘發(fā)的EPSC的代表性軌跡。（D)所 有4個(gè)組中海馬CAl神經(jīng)元（來自每組4-5只大鼠的η = 9-12個(gè)神經(jīng)元）中的LTP感應(yīng)的 時(shí)程。統(tǒng)計(jì)顯著性通過方差的重復(fù)測(cè)量分析隨后Student-Newman-Keuls多范圍檢驗(yàn)來確 定。數(shù)據(jù)顯示為平均值土SEM。*Ρ〈0· 05 ;#Ρ〈0· 01，相對(duì)于A β…和A β H+MDA7組。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明人已經(jīng)證明，由MDA7激活中央小膠質(zhì)細(xì)胞082受體促進(jìn)A β清除，改善 A β誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞激活和IL-I β產(chǎn)生，并恢復(fù)突觸可塑性、認(rèn)知和記憶。因此，本發(fā)明提 供可用于治療神經(jīng)炎癥和/或神經(jīng)變性疾病，包括阿爾茨海默氏病的CB 2受體激動(dòng)劑。 定義
[0017] 如本文所用，下面的術(shù)語具有所指示的含義。如在本發(fā)明的描述和所附權(quán)利要求 中所用，單數(shù)形式"一（a)"、"一（an)"和"該（the)"包括其復(fù)數(shù)形式，除非其周圍的上下文 有禁忌。
[0018] 如本文所用，單獨(dú)或組合的術(shù)語"烯基"是指具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵并且含有2-20 個(gè)，優(yōu)選2-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴基。亞烯基是指在兩個(gè)或更多個(gè)位置連接的碳-碳 雙鍵系統(tǒng)，例如亞乙烯基[(CH = CH-)，（-C: :C_)]。合適的烯基的實(shí)例包括乙烯基、丙烯基、 2-甲基丙烯基、1，4- 丁二烯基等。
[0019] 如本文所用，單獨(dú)或組合的術(shù)語"烷氧基