貝母素甲用于制備新型免疫抑制劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及貝母素甲的新用途，尤其涉及貝母素甲用于制備新型免疫抑制劑的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] T淋巴細(xì)胞亞型參與免疫應(yīng)答的各個(gè)階段，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，當(dāng)免疫調(diào) 控紊亂以及免疫平衡調(diào)節(jié)機(jī)制破壞時(shí)將會(huì)導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生。自身免疫性疾病主要 包括硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血清病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，其發(fā)生的原因是由于對(duì)自己或 非己識(shí)別的控制機(jī)制出現(xiàn)了問題，使得一些自身反應(yīng)性T細(xì)胞能夠逃避克隆清除，識(shí)別自 身的外周組織抗原并且引起自身免疫反應(yīng)。通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞膜離子通道功能來改變T 細(xì)胞的活性，可達(dá)到治療自身免疫疾病的目的。目前，傳統(tǒng)治療自身免疫疾病的方法均以免 疫抑制為主，主要以遏制自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的增殖為目的，非特異性免疫抑制劑的應(yīng)用 以及特異地應(yīng)用免疫耐受T細(xì)胞的疫苗會(huì)對(duì)整個(gè)免疫系統(tǒng)進(jìn)行抑制，其結(jié)果往往導(dǎo)致疫苗 等毒性累積而出現(xiàn)嚴(yán)重副作用，同時(shí)會(huì)不同程度地影響機(jī)體正常免疫反應(yīng)而降低機(jī)體對(duì)感 染和腫瘤等免疫作用。
[0003] 鉀通道在T淋巴細(xì)胞的活化中起重要作用，T淋巴細(xì)胞活化的關(guān)鍵磷酸酶是鈣依 賴的神經(jīng)鈣蛋白磷酸酶，其中與T淋巴細(xì)胞關(guān)系最為密切的鉀離子通道是：電壓門控鉀通 道Kvl. 3和鈣激活依賴的鉀通道KCa3. 1 (也稱IKCal，KCNN4，hKCa4)。因此能選擇性抑 制電壓門控鉀通道Kvl. 3或鈣激活依賴的鉀通道KCa3. 1，都會(huì)影響T淋巴細(xì)胞的功能。
[0004]Kvl. 3鉀離子通道是人類T淋巴細(xì)胞上表達(dá)最豐富、生理功能最重要的一類電壓 依賴型鉀離子通道（PANYIG，2005JASONRetal，2010)，在T淋巴細(xì)胞的活化、增殖、分 化以及免疫功能調(diào)節(jié)中具有重要的作用，其表達(dá)數(shù)量與T細(xì)胞亞型、細(xì)胞分化狀態(tài)和細(xì)胞 活化狀態(tài)有關(guān)。Kvl. 3和11(&1共同為持續(xù)的鈣內(nèi)流提供必需的陽離子流出平衡，T細(xì)胞活 化需要通過鈣釋放的鈣通道從外部環(huán)境持續(xù)輸入鈣離子，鈣離子內(nèi)流使膜去極化。Kvl. 3的 開放適應(yīng)膜的去極化和維持膜的靜息電位，而IKCal開放則增加胞質(zhì)鈣和使膜電位超極化。 Kvl. 3是人類靜息T細(xì)胞鈣信號(hào)的基本調(diào)節(jié)器。
[0005] 鉀通道在T淋巴細(xì)胞的活化中起重要作用，開放通道增加跨膜電位負(fù)值，這就反 過來通過鈣釋放活化的鈣通道增加鈣內(nèi)流，進(jìn)一步導(dǎo)致鈣依賴的神經(jīng)鈣蛋白磷酸酶活化， 后者是T淋巴細(xì)胞活化的關(guān)鍵磷酸酶。增加表達(dá)的鉀通道能明顯使活化的T淋巴細(xì)胞超極 化，加速的鈣內(nèi)流保證了高水平的胞內(nèi)鈣離子，后者是T淋巴細(xì)胞充分活化和產(chǎn)生細(xì)胞因 子所必須的。相應(yīng)的，鉀通道阻滯劑使T淋巴細(xì)胞保持負(fù)性膜電位和長(zhǎng)效鈣信號(hào)的能力降 低。CD8+細(xì)胞分為三個(gè)主要的亞群，分別是幼稚細(xì)胞、中心記憶細(xì)胞和效應(yīng)記憶細(xì)胞。靜息 的人類T淋巴細(xì)胞表達(dá)Kvl. 3約300~400個(gè)/細(xì)胞，11(&1約8~10個(gè)/細(xì)胞，阻滯靜息 T細(xì)胞上的Kvl. 3能使膜電位從-50mV升到-30mV。靜息狀態(tài)，幼稚的中心記憶細(xì)胞（TCM) 和表達(dá)⑶4及⑶8的TCM都表達(dá)過多的Kv1. 3 (約200~300個(gè)/細(xì)胞），而IKCal僅僅表 達(dá)8~20個(gè)/細(xì)胞。幼稚的效應(yīng)細(xì)胞和TCM在抗原或絲裂原刺激后表達(dá)相似數(shù)量的兩種 通道（(Kvl. 3約400~500個(gè)/細(xì)胞，11(&1約200~500個(gè)/細(xì)胞）。而抗原或絲裂原刺 激的CD4+和CD8+TEM，Kvl. 3表達(dá)增加至1500個(gè)/細(xì)胞，遠(yuǎn)多于KCal的表達(dá)（約10個(gè)/ 細(xì)胞）。在人類的T淋巴細(xì)胞中，11(&1和Kvl. 3在T淋巴細(xì)胞的分化以及抗原介導(dǎo)的免疫反 應(yīng)如細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL)_2,腫瘤壞死因子（TNF)-A，干擾素（IFN)-C中起調(diào)節(jié)作用。
[0006] 因此，針對(duì)T淋巴細(xì)胞上的Kvl. 3和11(&1的鉀通道阻滯劑對(duì)抑制T淋巴 細(xì)胞增殖分化成為研宄的重點(diǎn)。早期研宄發(fā)現(xiàn)廣譜鉀離子通道阻滯劑4-氨基吡啶 (4-Aminopyridine，4-AP)能改善MS(多發(fā)性硬化癥）患者癥狀，但是由于其廣譜阻斷效應(yīng)， 副作用多，限制了它的應(yīng)用，因此以Kvl. 3和IKCal為靶點(diǎn)篩選出高選擇性的鉀離子通道阻 滯劑成為研宄的熱點(diǎn)。
[0007] 膜片鉗技術(shù)是用微玻管電極（膜片電極或膜片吸管）接觸細(xì)胞膜，以千兆歐姆以 上的阻抗使之封接，使與電極尖開口處相接的細(xì)胞膜的小區(qū)域（膜片）與其周圍在電學(xué)上 分隔，在此基礎(chǔ)上固定點(diǎn)位，對(duì)此膜片上的離子通道的離子電流（PA級(jí)）進(jìn)行監(jiān)測(cè)記錄的方 法。目前廣泛應(yīng)用于神經(jīng)（腦）科學(xué)、心血管科學(xué)、藥理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、病理生理學(xué)、中醫(yī) 藥學(xué)、植物細(xì)胞生理學(xué)、運(yùn)動(dòng)生理等多學(xué)科領(lǐng)域研宄。
[0008] 本發(fā)明旨在利用膜片鉗技術(shù)研宄貝母素甲免疫抑制的作用機(jī)制。通過在通道電流 記錄中，分別于不同時(shí)間、不同部位（膜內(nèi)或膜外）施加各種濃度的藥物，研宄它們對(duì)不同 電壓門控鉀通道功能的可能影響，其確定其是否對(duì)Kvl. 3鉀通道作用有選擇性阻滯作用。
[0009] 貝母素甲的概況
[0010] (1)貝母素甲（浙貝母堿）是從貝母類藥材中提取的一種生物堿，英文名稱： 卩611^116 ;貝母素甲的分子式為0271145勵(lì)3、分子量為431.6511，結(jié)構(gòu)式如下：
[0012] (2)貝母素甲廣泛存在于貝母類植物中。川貝母、浙貝母、伊貝母、平貝母和瓦布 貝母都已被《中國藥典》收錄，藥典規(guī)定含貝母素甲（C27H45N03)和貝母素乙（C27H43N03)的總 量，不得少于〇. 080%。貝母來源于百合科貝母屬多種植物的鱗莖，具有清熱潤(rùn)肺，化痰止 咳之功效。貝母中的生物堿種類多，是貝母止咳、化痰作用的有效成分。貝母為多年生草本 植物，葉子長(zhǎng)形，似韭，花黃綠色，下垂像鐘，其鱗莖供藥用，有止咳化痰、清熱散結(jié)之功，產(chǎn) 于四川、云南、甘肅、新疆等地。貝母為名貴藥材，堪稱藥中之寶。新中國成立后曾列為國家 計(jì)劃管理品種，1980年以后改為市場(chǎng)調(diào)節(jié)產(chǎn)銷產(chǎn)品。40年來，貝母的生產(chǎn)有較大的發(fā)展，年 產(chǎn)量由20世紀(jì)50年代初的40多噸發(fā)展到2000年的2000噸左右，2014年產(chǎn)量估算接近 4000噸，產(chǎn)值接近70000萬元，具備較大的市場(chǎng)供應(yīng)能力及開發(fā)潛力。
[0013] (3)貝母素甲的提取與純化方法：
[0014] 貝母素甲的提取方法大致有3類，一是傳統(tǒng)的搖床浸提法，為了提高生物堿的提 取率，人們還輔助添加了微波法和超聲法；二是滲漉法，可用不同濃度的鹽酸進(jìn)行提取；三 是醇提法，常用80% -95%的甲醇或乙醇進(jìn)行提取，人們還在醇提工藝前使用纖維素酶預(yù) 處理，降解細(xì)胞壁中的纖維素，促進(jìn)有效成分溶出，提高提取率。
[0015] 常用的純化方法有：大孔樹脂純化法和萃取純化法兩種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供貝母素甲在制備用于選擇性抑制Kvl. 3離子通道的 藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種新型免疫抑制劑。
[0017] 為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
[0018] 式（I)所示貝母類化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備新型免疫抑制劑的應(yīng) 用；所述的新型免疫抑制劑的作用機(jī)制主要通過選擇性抑制Kvl. 3鉀離子通道；
[0020] 作為優(yōu)選，所述的免疫抑制劑預(yù)防和/或治療的自身免疫疾病包括器官特異性自 身免疫病和系統(tǒng)性自身免疫?。黄鞴偬禺愋宰陨砻庖卟≈薪M織器官的病理損害和功能障礙 僅限于抗體或致敏淋巴細(xì)胞所針對(duì)的某一器官。
[0021] 作為優(yōu)選，器官特異性自身免疫病包括慢性淋巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)、胰 島素依賴型糖尿病、重癥肌無力、慢性潰瘍性結(jié)腸炎、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、肺出血 腎炎綜合征（goodpasturesyndrome)、尋常天皰瘡、類天皰瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬變、多發(fā) 性腦脊髓硬化癥和急性特發(fā)性多神經(jīng)炎。
[0022] 作為優(yōu)選，系統(tǒng)性自身免疫病包括硬皮病、紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和結(jié)節(jié)性多 動(dòng)脈炎。
[0023] 為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
[0024] -種新型免疫抑制劑，它的有效成分為上述的貝母類化合物或其藥物學(xué)上可接受 的鹽，其作用機(jī)制主要通過選擇性抑制Kvl. 3鉀離子通道。
[0025] 作為優(yōu)選，所述的免疫抑制劑預(yù)防和/或治療的自身免疫疾病包括器官特異性自 身免疫病和系統(tǒng)性自身免疫病；器官特異性自身免疫病中組織器官的病理損害和功能障礙 僅限于抗體或致敏淋巴細(xì)胞所針對(duì)的某一器官。
[0026] 作為優(yōu)選，器官特異性自身免疫病包括慢性淋巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)、胰 島素依賴型糖尿病、重癥肌無力、慢性潰瘍性結(jié)腸炎、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、肺出血 腎炎綜合征（goodpasturesyndrome)、尋常天皰瘡、類天皰瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬變、多發(fā) 性腦脊髓硬化癥和急性特發(fā)性多神經(jīng)炎。
[0027] 作為優(yōu)選，系統(tǒng)性自身免疫病包括硬皮病、紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和結(jié)節(jié)性多 動(dòng)脈炎。
[0028] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果：經(jīng)過貝母素甲對(duì)Kvl. 2-Kvl. 8離子通道抑制作用的試 驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)貝母素甲能與Kvl. 3通道有較強(qiáng)選擇性結(jié)合，從而降低過度興奮的T淋巴細(xì)胞，減 弱對(duì)于T淋巴細(xì)胞的活化，從而降低T細(xì)胞活性，最終降低細(xì)胞免疫，而對(duì)其它鉀離子通道 作用很弱。由于貝母素甲是選擇性通過抑制Kvl. 3離子通道，可以降低如硬皮病，紅斑狼瘡 等免疫系統(tǒng)功能亢進(jìn)疾病治療所引起的不良反應(yīng)而不影響正常的免疫功能，因此這一類新 藥的開發(fā)具有重大意義。
【附圖說明】
[0029] 附圖1貝母素甲對(duì)Kvl. 3離子通道的抑制作用；
[0030]A不同濃度貝母素甲對(duì)Kvl. 3離子通道電流的影響；B貝母素甲對(duì)Kvl. 3峰值電流 的量效曲線；采用Hill方程式得出其50%抑制濃度（IC5Q)為354. 4yM(n= 6);
[0031]CKvl. 3電流激活后的150ms處出現(xiàn)對(duì)電流使用依賴性量效曲線；數(shù)據(jù)符合Hill 方程，50 %使用依賴性抑制濃度（use-dependentIC5(I)為 142. 1yM(n= 6)。
[0032] 附圖2貝母素甲對(duì)Kvl. 2離子通道的end-pulse(穩(wěn)態(tài)后的）電流的抑制百分率；