一種水蛭素凍干粉針劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水蛭素凍干粉針劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水蛭是我國傳統(tǒng)中藥，1800年前《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。中醫(yī)認為它有破血、逐瘀、通經(jīng)的療效，主要用于治療瘕癥、痞塊、血瘀、閉經(jīng)和跌打損傷。西方也常用水蛭吸血以治療某些疾病。從水蛭及其唾液腺中已提取出多種活性成分，水蛭素是其中活性最顯著并且研宄得最多的一種成分，它是由65-66個氨基酸組成的下分子蛋白質(zhì)(多肽)。水蛭素對凝血酶有極強的抑制作用，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最強的凝血酶天然特異抑制劑。動物是呀與臨床研宄表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反應(yīng)等一步血瘀現(xiàn)象。此外，它還能抑制凝血酶誘導(dǎo)的成纖維細胞的增殖和凝血酶對內(nèi)皮細胞的刺激。與肝素相比，它不僅用量少，不會引起出血，也不依賴于內(nèi)源性輔助因子；而肝素則有引起出血的危險，在彌漫性血管內(nèi)凝血的發(fā)病過程中抗凝血酶③往往減少，這將限制肝素的療效，采用水蛭會有較好的效果。水蛭素是一類很有前途的抗凝化瘀藥物，它可用于治療各種血栓疾病，尤其是靜脈血栓和彌漫性血管凝血治療；也可用于外科手術(shù)后預(yù)防動脈血栓的形成，預(yù)防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善體外血液循環(huán)和血液透析過程。在顯微外科手術(shù)中常因為吻合處血管栓塞而導(dǎo)致手術(shù)失敗，采用水蛭素可促進傷口愈合。動物試驗和臨床研宄表明，靜脈或皮下注射水蛭素均無明顯毒副作用，無論急性、亞急性的毒性試驗，對血壓、心率、血相、出血時間和血液化學(xué)成分均不受影響，呼吸系統(tǒng)也沒有影響，無過敏反應(yīng)，一般無特異抗體發(fā)現(xiàn)。半致死劑量LD50 > 50mg/kg，遠大于治療所用的劑量(lmg/kg)。水蛭素比較穩(wěn)定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破壞其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用。近幾年，研宄重組水蛭素的越來越多，但是，重組水蛭素與天然水蛭素相比存在兩方面天性的缺陷:一方面，重組水蛭素雖然在氨基酸序列和結(jié)構(gòu)與天然水蛭素極其相似，但在63位絡(luò)氨酸殘基上硫基的缺失，使重組水蛭素對凝血酶的抑制常數(shù)比天然水蛭素降低了 90% ;另一方面，一個重要的原因是水蛭素良好的藥用效果不僅僅在于水蛭素的作用，還有水蛭唾液中的其他活性成分的參與作用共同形成的。這些是重組水蛭素與生俱來無法克服的先天缺陷，使其進行深入的開發(fā)應(yīng)用加大了難度。
[0003]凝血酶是導(dǎo)致血栓的主要因素之一，而血栓的形成是導(dǎo)致心腦血管疾病的主要原因。心腦血管疾病是目前危害人類生命和健康的主要疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，全世界每年大約有1700萬人死于心腦血管病，即全球每3個死亡者中就有I個死于心腦血管疾病。預(yù)計到2020年，因心腦血管疾病死亡的人數(shù)將比該數(shù)字增加50%，高達2500萬人。我國60歲以上人口哦已過億，這個年齡層次病發(fā)率每年在5%以上，即我國每年有500萬人需用抗凝藥物來防治和治療心腦血管疾病，并且這類疾病已經(jīng)向年輕化發(fā)展。若按1%人數(shù)計算，發(fā)病率的基數(shù)會更大。
[0004]專利申請?zhí)枮?31143566的專利公開了提取純化水蛭素的方法，該方法是從活體水蛭的唾液分泌物中用丙酮提取水蛭素，再用柱層析法進行純化，只應(yīng)用了陰離子交換柱層析(凝膠過濾柱層析只是分子篩的作用)進行純化，雜質(zhì)沒有完全分離，水蛭素的純度不高，也未見該專利關(guān)于水蛭素純度的報道；申請?zhí)枮?5117701的專利公開了采用親和色譜法純化水蛭素，但在實際應(yīng)用過程中，只適用于實驗室，才能進一步中試放大和生產(chǎn)，不利于產(chǎn)業(yè)化推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]基于上述原因，本發(fā)明提供一種水蛭素凍干粉針劑的制備方法，采用超濾、陰離子交換、陽離子交換柱層析法進行除雜，再用透析袋濃縮法去除提取過程中產(chǎn)生的鹽類物質(zhì)，指水蛭素的純度大大提高。
[0006]為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種水蛭素凍干粉針劑的制備方法，包括以下步驟:
(A)取水蛭，加入注射用水，洗去雜質(zhì)后破碎，制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30°C冰柜凍結(jié)20-24小時，再用乙醇解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融3-5次，最后一次解凍后，加氯化鈉溶液，攪拌，再用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清液備用；
(B)將上清液進行超濾，超濾至原溶液體積的1/3-1/2時，加水至原體積，反復(fù)操作3-5次，合并透過液，20°C下濃縮至相對密度為1.05-1.10的溶液；
(C)將濃縮的過濾液用緩沖液調(diào)PH值為5.0-7.0，離子強度為0.0lmol/Ι通過陽離子交換柱，用緩沖液洗46倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)PH值為5.0-7.0通過陰離子交換柱，分別用PH值為7.3-7.5、7.1-7.3的緩沖液各洗I倍柱體積，洗脫液棄去，最后用PH值為7.1-7.3的緩沖液加入0.0lmol/Ι的氯化鈉進行洗脫，收集洗脫液，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止；
(D)洗脫液濃縮脫鹽，得到水蛭素半成品；
(E)將水蛭素半成品加或不加藥用輔料，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，軋蓋，檢測，得到水蛭素凍干粉針劑。
[0007]所述的步驟(A)中乙醇的濃度為70% -80%。
[0008]所述的步驟(A)中氯化鈉的加入量為原料的1-3倍，濃度為0.1-0.2mol/Lo
[0009]所述的步驟(C)中緩沖溶液為磷酸鹽緩沖或者三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的一種。
[0010]所述的步驟(C)中陽離子交換柱選自CM-交聯(lián)葡聚糖、CM-瓊脂糖、CM-纖維素、SP-交聯(lián)葡聚糖、SP-瓊脂糖、SP-纖維素中的一種。
[0011]所述的步驟(C)中陰離子交換柱選自DEAE-交聯(lián)葡聚糖、DEAE-瓊脂糖、DEAE-纖維素、Q-交聯(lián)葡聚糖、Q-瓊脂糖、Q-纖維素中的一種。
[0012]所述的步驟(D)中濃縮脫鹽采用透析袋濃縮法，具體操作為:
將洗脫液放入透析袋，結(jié)扎，把高分子聚合物聚乙二醇(碳蠟)、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖中的一種撒在透析袋外即可；或者將吸水劑配成30% — 40%濃度的溶液，將裝有洗脫液的透析袋放入即可，吸水劑用過后，放入溫箱中烘干或自然干燥后，循環(huán)使用。
[0013]本發(fā)明的有益效果為:
本發(fā)明的制備方法用乙醇代替水對水蛭勻漿進行解凍，效果更好，效率更高，同時醇提效果比水提更優(yōu)。本發(fā)明采用超濾、陰離子交換、陽離子交換柱層析法進行除雜，再用透析袋濃縮法去除提取過程中產(chǎn)生的鹽類物質(zhì)，指水蛭素的純度大大提高。本發(fā)明的水蛭素制備方法操作性、實用性強，有利于產(chǎn)業(yè)化推廣。
【具體實施方式】
[0014]為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0015]實施例1
本發(fā)明的水蛭素凍干粉針劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
(A)取水蛭，加入注射用水，洗去雜質(zhì)后破碎，制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30°C冰柜凍結(jié)20小時，再用乙醇解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融3次，最后一次解凍后，加入氯化鈉，攪拌，再用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清液備用；
(B)將上清液進行超濾，超濾至原溶液體積的1/3-1/2時，加水至原體積，反復(fù)操作3次，合并透過液，20°C下濃縮至相對密度為1.05的溶液；
(C)將濃縮的過濾液用緩沖液調(diào)PH值為5.0，離子強度為0.0lmol/Ι通過陽離子交換柱，用緩沖液洗46倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)PH值為5.0-7.0通過陰離子交換柱，分別用PH值為7.3,7.1的緩沖液各洗I倍柱體積，洗脫液棄去，最后用PH值為7.1的緩沖液加入0.0lmol/Ι的氯化鈉進行洗脫，收集洗脫液，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止；
(D)洗脫液濃縮脫鹽，得到水蛭素半成品；
(E)將水蛭素半成品加或不加藥用輔料，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，軋蓋，檢測，得到水蛭素凍干粉針劑。
[0016]所述的步驟(A)中所述的乙醇的濃度為70%。
[0017]所述的步驟(A)中氯化鈉的加入量為原料的I倍，濃度為0.lmol/Lo
[0018]所述的步驟(C)中緩沖溶液為磷酸鹽緩沖或者三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的一種。
[0019]所述的步驟(C)中陽離子交換柱為CM-交聯(lián)葡聚糖。
[0020]所述的步驟(C)中陰離子交換柱為DEAE-交聯(lián)葡聚糖。
[0021]所述的步驟(D)中濃縮脫鹽采用透析袋濃縮法，具體操作為:
將洗脫液放入透析袋，結(jié)扎，把高分子聚合物聚乙二醇撒在透析袋外即可。
[0022]實施例2
本發(fā)明的水蛭素凍干粉針劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
(A)取水蛭，加入注射用水，洗去雜質(zhì)后破碎，制成勻漿；將勻漿分