一種組織工程角膜的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程角膜的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]角膜是維持人體正常視力的組織之一，角膜的急性損傷、穿孔、潰瘍、病變等造成的視力下降或失明，甚至眼球摘除，給患者的正常生活和心理造成極大的影響。
[0003]現(xiàn)今，角膜盲已成為全球第二大致盲性疾病，治療角膜盲最為有效的方法是角膜移植，然而角膜來源缺乏，導(dǎo)致患者不能及時治療而終生失明。根據(jù)統(tǒng)計而知，我國大約有400萬角膜盲患者需要角膜移植，然而僅有不到萬例的患者有供體角膜進(jìn)行移植。角膜供體來源的匱乏，制約了角膜盲患者的治療。
[0004]人體正常角膜為橢圓形，橫徑為11.5—12cm，垂直徑約為10.5—11mm。周邊厚度約為1mm，中央稍薄約為0.6mm。其前表面的曲率半徑為7.8mm，后表面為6.8mm。角膜由外向內(nèi)共有5層結(jié)構(gòu)，分別為上皮細(xì)胞層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層。角膜緣為環(huán)狀區(qū)域，在角膜與鞏膜交界處，是角膜的干細(xì)胞富集區(qū)域，含有大量角膜干細(xì)胞，可用于組織工程角膜的體外構(gòu)建。
[0005]目前組織工程技術(shù)的發(fā)展和近年來的研宄表明，在組織工程技術(shù)思想的支撐下，采用種子細(xì)胞和支架材料的方式，可以體外制備組織工程角膜，進(jìn)行角膜損傷患者的治療，甚至角膜替代移植。
[0006]目前現(xiàn)有技術(shù)表明(如中國專利201410264542.X和201410230365.3)，其制備的人工角膜僅提供支架材料，缺乏具有活性功能的種子細(xì)胞，在植入體內(nèi)進(jìn)行修復(fù)時，僅依靠患者患處細(xì)胞修復(fù)能力進(jìn)行損傷修復(fù)，延長了治療過程的同時，也增加了修復(fù)失敗的概率，同時，其制備的支架材料為外源性材料，植入后與患者組織相容性差，有排異的風(fēng)險。
[0007]中國專利03140113.9公開了一種人工組織工程化生物角膜，采用了上皮和內(nèi)皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞，但所用載體為動物組織或異體的角膜成分，其保留了外援細(xì)胞或細(xì)胞殘余組分，并且未對殘余組分進(jìn)行控制描述，其會引起人體的免疫排斥和病毒交叉感染，導(dǎo)致植入修復(fù)后患者對植入物的排異反應(yīng)，造成治療失敗，同時所用種子細(xì)胞不具有分化的多潛能性，造成治療效果的局限性，同時，此類方法，都需要采用體外培養(yǎng)的方式擴(kuò)增細(xì)胞，改變了細(xì)胞的生存環(huán)境，加大了細(xì)胞變異的可能性，同時細(xì)胞培養(yǎng)過程漫長，延緩了治療過程，而且可能面臨二次手術(shù)的，給患者健康帶來潛在的危害。
[0008]因此，本發(fā)明以解決上述現(xiàn)有技術(shù)的問題為目的，即本發(fā)明的目的在于提供模擬人體正常角膜的結(jié)構(gòu)和功能，實現(xiàn)角膜移植治療的替代物的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種生物相容性高、透明度好、力學(xué)性能強(qiáng)，可應(yīng)用于人體角膜移植手術(shù)的全層修復(fù)的組織工程角膜的制備方法。
[0010]該組織工程角膜的制備，包括以下步驟， 步驟一、動物源性角膜的選取和前處理:
選取包含有前彈力層的動物源性角膜，將其置于添加抗生素的、溫度在2?30°C的去離子水中浸泡8?24h，待所述動物源性角膜厚度溶脹到2?5倍厚度后，該動物源性角膜的上皮細(xì)胞層會由于后彈力層脹起而脫落，同時抗生素的使用，可以有效去除該動物源性角膜組織的細(xì)菌，獲得無菌的、去除了上皮細(xì)胞層的動物源性角膜組織材料；
步驟二、角膜各層的分離:
將步驟一制備所得的動物源性角膜組織材料置于角膜切削設(shè)備中，切削獲得前彈力層組織片、基質(zhì)層組織片和后彈力層組織片，實現(xiàn)角膜各層的分離；
步驟三、將步驟二制備所獲得的前彈力層組織片、基質(zhì)層組織片和后彈力層組織片去抗原、病毒滅活處理后，采用質(zhì)量百分比濃度為60%?95%的甘油對去抗原、病毒滅活處理后的前彈力層組織片、基質(zhì)層組織片和后彈力層組織片進(jìn)行脫水處理，然后在2?30°C的溫度條件下，使前彈力層組織片、基質(zhì)層組織片和后彈力層組織片恢復(fù)至溶脹前的生理狀態(tài)，同時置于所述甘油中保持待用；
步驟四、制備細(xì)胞混懸液:
將人角膜緣組織置于25?37°C預(yù)熱的胰酶溶液中消化細(xì)胞，胰酶濃度為0.1%?0.25%，消化時間為I?lOmin，后采用人血清終止消化，800?1200rpm離心收集細(xì)胞，隨后采用溶液A將收集的細(xì)胞制備成細(xì)胞混懸液，待用。
[0011]所述溶液A是體積百分?jǐn)?shù)為10%?30%的人血清、膠原溶液和透明質(zhì)酸溶液中的任一種或兩種的混合或三種的混合溶液；
所述細(xì)胞混懸液的細(xì)胞濃度為I X 14至2X10 5個細(xì)胞每毫升；
步驟五、組織工程角膜的構(gòu)建:
將步驟四制備的細(xì)胞混懸液涂布于步驟三制備的前彈力層組織片、基質(zhì)層組織片和后彈力層組織片上，在25?37°C下靜置至少30min后，讓細(xì)胞有效附著于彈力層組織片、基質(zhì)層組織片和后彈力層組織片的表面；
再將表面上附著了細(xì)胞的前彈力層組織片、基質(zhì)層組織片和后彈力層組織片，以后彈力層組織片在下、基質(zhì)層組織片居中和前彈力層組織片在上的順序堆疊，同時對其進(jìn)行交聯(lián)和加固以固定各層，制得所述組織工程角膜。
[0012]上述抗生素為青霉素類、頭孢菌素類、鏈霉素、慶大霉素、紅霉素和白霉素的一種或兩種或多種混合。
[0013]上述前彈力層組織片和后彈力層組織片的切削厚度為所述動物源性角膜組織材料的厚度的5%?10%。
[0014]上述去抗原后的前彈力層組織片、基質(zhì)層組織片和后彈力層組織片的DNA殘留量在I?100mg/ml之間，其脂性物質(zhì)含量應(yīng)在1%以下。
[0015]上述細(xì)胞混懸液的pH值在5?9之間，細(xì)胞混懸液300nm至800nm的透光率在80%以上，細(xì)胞混懸液的滲透壓在200?380 mOsmol/L之間。
[0016]上述人血清是接收角膜移植或修復(fù)的患者自身制備的血清或正常健康的人通過采血而制備的，并進(jìn)行補(bǔ)體滅活操作后的人血清。
[0017]上述交聯(lián)是指采用核黃素光催化的交聯(lián)操作，在后彈力層組織片與基質(zhì)層組織片之間、基質(zhì)層組織片和前彈力層組織片之間滴加核黃素溶液，并充分去除層間氣泡，使后彈力層組織片、基質(zhì)層組織片和前彈力層組織片中的核黃素溶液達(dá)到15?50 μ g/g的濃度，再通過波長在350?390nm范圍內(nèi)的光照射，進(jìn)行光催化的交聯(lián)。
[0018]上述加固是采用生物蛋白膠在所構(gòu)建的后彈力層組織片與基質(zhì)層組織片的層間邊緣處、基質(zhì)層組織片和前彈力層組織片的層間邊緣處進(jìn)行黏連，所述的生物蛋白膠是纖維蛋白原濃縮液和凝血酶的混合液。
[0019]上述動物源性角膜為猿、猴子、猩猩、豬、牛和雞的角膜中的任一種
上述的組織工程角膜，其特征在于300nm?800nm范圍內(nèi)光通過率在50%?90%之間，其縫線撕裂力在0.3?5N之間。
[0020]與現(xiàn)有產(chǎn)品及技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
本方法制備的組織工程角膜，采用人角膜緣細(xì)胞復(fù)合生物支架材料的方式獲得最終的組織工程角膜，此方法制備的組織工程角膜在使用方面具有組織相容性高，可以產(chǎn)業(yè)化制備等優(yōu)點。同時所采用細(xì)胞未經(jīng)過體外擴(kuò)增培養(yǎng)，細(xì)胞性狀穩(wěn)定，不易分化，保證了組織工程角膜的安全性。
[0021]【附圖說明】:
圖1制備的豬角膜復(fù)合人角膜緣細(xì)胞的組織工程角膜實物圖。
[0022]圖2采用組織工程角膜修復(fù)兔眼角膜損傷14天修復(fù)效果實物圖。
[0023]圖3兔眼角膜修復(fù)后HE染色實物圖。
【具體實施方式】
[0024]本實施例的目的是通過提供一種高仿生的組織工程角膜的制備方法，獲取具有天然角的前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層、以及與內(nèi)皮細(xì)胞層阻水功能相似的阻水層，且生物相容性高、透明度好、力學(xué)性能強(qiáng)的特點，可應(yīng)用于人體角膜移植手術(shù)的全層修復(fù)的組織工程角膜。
[0025]該組織工程角膜的制備方法，主要包括動物源性角膜前處理，角膜各層的分離，脫細(xì)胞、病毒滅活處理，細(xì)胞混懸液制備和組織工程角膜的構(gòu)建，具體制備過程如下:
步驟一，動物源性角膜前處理:
將動物源性角膜取材后，置于添加抗生素的、2~30°C的去離子水浸泡8~24h，天然的角膜會由于吸水而溶脹，其厚度可溶脹到2~5倍厚度后，角膜上皮細(xì)胞層會由于后彈力層脹起而脫落，同時抗生素的使用，可以有效去除角膜組織的細(xì)菌，獲得無菌材料。
[0026]本步驟所述的抗生素為青霉素類、頭孢菌素類、鏈霉素、慶大霉素、紅霉素和白霉素的一種或兩種或多種的混合。
[0027]本步驟所述的動物源性角膜，為包含有前彈力層的角膜，由于動物種屬差異，有些動物的角膜缺失前彈力層，故本發(fā)明所述動物優(yōu)先選用靈長類動物如猿、猴子和猩猩，同時也可以采用豬、牛和雞的角膜.通過本步驟處理，獲得的材料包括天然角膜的前彈力層組織、基質(zhì)層組織和后彈力層組織，去除了角膜的上皮細(xì)胞層組織。而角膜的內(nèi)皮細(xì)胞層組織，其生理機(jī)構(gòu)為單層的細(xì)胞組織，在實際操作中，目前現(xiàn)有技術(shù)難于獲得單細(xì)胞層組織，而且后續(xù)步驟中有脫細(xì)胞處理，會完全破壞其結(jié)構(gòu)，故不進(jìn)行過多說明。
[0028]步驟二，角膜各層的分離: 將上述步驟的組織置于角膜切削設(shè)備中，切削獲得前彈力層組織片、基質(zhì)層組織片和后彈力層組織片，實現(xiàn)角膜各層的分離。
[0029]正常角膜90%的厚度均為基質(zhì)層，而剩余的厚度主要為上皮細(xì)胞層、前彈力層和后彈力層，而本步驟中所用角膜為去除了上皮細(xì)胞層的角膜，其層間順序為前彈力層、基質(zhì)層和后彈力層，前彈力層和后彈力層的切削厚度，為步驟一處理后材料厚度的5%?10%，可以有效保證所獲得完整的前彈力層和后彈力層組織片。
[0030]本步驟所述的角膜切削設(shè)備，優(yōu)先采用飛秒激光，可以精準(zhǔn)切削角膜組織片，同時還可以是采用顯微角膜切削刀或類似的手術(shù)器械進(jìn)行角膜的切削。
[0031]步驟三，去抗原、病毒滅活處理
將上步驟所獲得的組織片采用，但不限于中國專利201310003274.1中所述的脫細(xì)胞和病毒滅活的方法進(jìn)行處理，獲得低免疫原性的脫毒組織。在此基礎(chǔ)上，本步驟還需要采用60%?95%的甘油對上述處理的組織片進(jìn)行脫水處理，處理溫度在2?30°C，使角膜組織恢復(fù)溶脹前的生理狀態(tài)，同時置于上述甘油中保持待用。
[0032]本步驟所述的組織片，其特征在于通過處理后，其DNA殘留量應(yīng)在I?100mg/ml之間，其脂性物質(zhì)含量應(yīng)在1%以下。
[0033]步驟四，細(xì)胞混懸液制備:
將人角膜緣組織置于25?37°C預(yù)熱的胰酶溶液中消化細(xì)胞，胰酶濃度為0.1%?
0.25%，消化時間為I?lOmin，后采用人血清終止消化，800?1200rpm