刺激敏感性微粒和使用方法
【專利說明】刺激敏感性微粒和使用方法
[0001] 相關(guān)申請的的交叉引用 本申請按35 U.S.C. §119 (e)要求提交于2012年9月27日的美國臨時(shí)申請?zhí)?61/706, 126的權(quán)益，其通過引用以其整體結(jié)合到本文中用于所有目的。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 提供了刺激敏感性微粒及其用途，例如，在示蹤從細(xì)胞混合物中回收稀少細(xì)胞群 體（例如，循環(huán)腫瘤細(xì)胞）的效率中的用途；和在提供對照核酸以指標(biāo)化不依賴于稀少細(xì)胞 選擇步驟的分子測定中的用途。
[0003] 發(fā)明背景 實(shí)體組織癌開始生長于原發(fā)位點(diǎn)。隨著疾病進(jìn)展，轉(zhuǎn)移出現(xiàn)在遠(yuǎn)端位置。這些轉(zhuǎn)移事 件加速疾病并最后導(dǎo)致死亡。作為轉(zhuǎn)移過程的一部分，細(xì)胞或細(xì)胞碎片離開原發(fā)位點(diǎn)。轉(zhuǎn) 移的過程是復(fù)雜的。一部分轉(zhuǎn)移過程涉及稀少循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC)。越來越清楚在給定的 患者中這些CTC不是整體（monolithic)群體?；颊咧械腃TC分級對于理解突變（其是折 磨患者的癌癥的原因）是必要的。純化和分離這些稀少腫瘤細(xì)胞（或細(xì)胞衍生事件）對于 定義在患者的血中的致癌突變是必須的。許多細(xì)胞和細(xì)胞碎片存在于不含突變的全血中， 因此為了分離有用的攜帶突變的細(xì)胞，需要純化策略。
[0004] 為了通過任何技術(shù)從細(xì)胞混合物中測量在稀少細(xì)胞群體(例如，循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC))的DNA基因組中的突變，需要足夠數(shù)量或質(zhì)量的DNA。通常2-4 ml的全血，可期望 回收2-10個(gè)CTC。此數(shù)量的細(xì)胞必須用優(yōu)秀的回收處理以確保攜帶突變的染色體在處理期 間不被丟失。
[0005] 簡述 本文公開的實(shí)施方法部分地基于熱不穩(wěn)定性微球的發(fā)現(xiàn)以及它們在示蹤從稀少細(xì)胞 群體的細(xì)胞中分離基因組DNA的效率中的用途，所述稀少細(xì)胞群體從細(xì)胞混合物（例如，來 自生物樣本）中分離。本文中描述的熱不穩(wěn)定性微球和示蹤方法提供了多步驟過程內(nèi)部對 照能力，其允許用于性能的校準(zhǔn)，例如，在細(xì)胞分離的水平上和也在基因組DNA分離的水平 上。
[0006] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了熱不穩(wěn)定性微球。在一些實(shí)施方案中，熱不穩(wěn)定性微 球包括： i) 熱不穩(wěn)定性聚合物，其包括內(nèi)部空間和外部表面，其中所述聚合物在內(nèi)部空間中含 有靶核酸，其中所述聚合物包含明確的熔點(diǎn)并在大于約50°C的溫度下釋放核酸；和 ii) 與聚合物的外部表面連接的免疫原性表位或抗原，或表面或其它標(biāo)志物。在一些實(shí) 施方案中，熱不穩(wěn)定性微球另外包括：iii)可檢測的標(biāo)記并且當(dāng)其被包含于熱不穩(wěn)定性聚 合物內(nèi)時(shí)是可檢測的。任選地，可檢測的標(biāo)記被包含于熱不穩(wěn)定性微球的內(nèi)部空間。在一 些實(shí)施方案中，熱不穩(wěn)定性聚合物是同聚物。在一些實(shí)施方案中，熱不穩(wěn)定性聚合物包含在 約50°C -約110°C的溫度范圍內(nèi)的明確的熔點(diǎn)，例如，在約50-60°C或55-65°C的范圍內(nèi)，例 如，約50。〇、55。〇、60。〇、65。〇、70。〇、75。〇、80。〇、85。〇、90。〇、95。〇、1001：、105。〇或1101：。在 一些實(shí)施方案中，熱不穩(wěn)定性聚合物包括這樣的聚合物，其在水性緩沖液中在大于約50°C 的溫度下(例如，大于約55°C，大于約60°C或大于約65°C )被降解。在一些實(shí)施方案中，熱不 穩(wěn)定性聚合物選自聚己內(nèi)酯（PCL)、聚L-賴氨酸（PLL)、聚苯乙烯、聚異丁烯酸甲酯（PMMA)、 聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA)、聚異丙基丙烯酰胺、丁基乙烯基醚、順式氯丁二烯、己二酸 乙二酯、氧化乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、乙基乙烯基醚、反式異戊二烯、聚（己烯1)、聚（異丁 烯酸甲酯）、聚（氯乙烯）、氧化丙烯、丙基乙烯基醚和乙烯基乙縮醛。在一些實(shí)施方案中， 熱不穩(wěn)定性聚合物是生物可降解的。在一些實(shí)施方案中，熱不穩(wěn)定性聚合物是生物可降解 的聚酯。在一些實(shí)施方案中，熱不穩(wěn)定性聚合物是聚己內(nèi)酯（PCL)。在一些實(shí)施方案中，聚 己內(nèi)酯（PCL)包含在約Mn 10, 000-約Mn 90, 000的范圍（例如，約Mn 10, 000-14, 000、Mn 45, 000或Mn 70, 000-90, 000)中的分子重量。在一些實(shí)施方案中，熱不穩(wěn)定性聚合物是聚 羥基鏈烷酸酯。在一些實(shí)施方案中，微球具有在約10-30 Mm的范圍（例如，在約20-30 Mm 的范圍內(nèi)，例如，約 10 Mm、ll Mm、12 Mm、13 Mm、14 Mm、15 Mm、16 Mm、17 Mm、18 Mm、19 Mm、20 Mm、21 Mm、22 Mm、23 Mm、24 Mm、25 Mm、26 Mm、27 Mm、28 Mm、29 Mm 或 30 Mm 的平均或均值直 徑）內(nèi)的大小。在一些實(shí)施方案中，靶核酸被包含于DNA質(zhì)粒中。在一些實(shí)施方案中，靶核 酸編碼非人DNA序列或突變的人DNA序列或人造的DNA序列。在一些實(shí)施方案中，靶核酸 編碼基因，其選自質(zhì)粒維持蛋白ccdB和3'，5' -環(huán)腺苷一磷酸磷酸二酯酶cpdA。在一些實(shí) 施方案中，免疫原性表位或抗原，或表面或其它標(biāo)志物包括一種或多種CTC相關(guān)的標(biāo)志物， 例如，上皮細(xì)胞粘附分子（Ep-CAM)、KRT19、MUC1、CEACAM5、BIRCS、SCGB2A2 和 ERBB2。在一 些實(shí)施方案中，免疫原性表位或抗原，或表面或其它標(biāo)志物選自生物素、上皮細(xì)胞粘附分子 (Ep-CAM)和洋地黃毒苷。在一些實(shí)施方案中，可檢測的標(biāo)記是焚光基團(tuán)。在一些實(shí)施方案 中，熒光基團(tuán)包含約460 nm的激發(fā)峰和約500 nm的發(fā)射峰，例如，F(xiàn)AM。在一些實(shí)施方案 中，熒光基團(tuán)選自氧雜蒽衍生物（例如，熒光素、若丹明、俄勒閃綠、伊紅和德克薩斯紅）、花 青衍生物（例如，花青、靛炭花青、氧雜炭花青、硫雜炭花青和部花青）、萘衍生物（例如，丹 酰和氟硅酸鈉（prodan)衍生物）、香豆素衍生物（例如，羥基香豆素、甲氧基香豆素和氨基 香豆素）、噁二唑衍生物（例如，吡啶基噁唑、硝基苯噁二唑和苯噁二唑）、芘衍生物（例如， 瀑布藍(lán)（cascade blue))、噁嗪衍生物（例如，尼羅紅、尼羅藍(lán)、甲酚紫、噁嗪170)、叮啶衍生 物（例如，二氨基吖啶、叮啶橙、叮啶黃）、芳基甲川衍生物（例如，金胺、結(jié)晶紫、孔雀石綠） 和四吡咯衍生物（例如，撲吩、酞菁、膽紅素）。
[0007] 在另外的方面中，本發(fā)明提供了示蹤從細(xì)胞混合物中回收稀少細(xì)胞群體的細(xì)胞的 效率的方法。在一些實(shí)施方案中，方法包括： a) 將預(yù)定數(shù)量的如上面和本文中描述的熱不穩(wěn)定性微球與細(xì)胞混合物(其被懷疑包含 稀少細(xì)胞群體的細(xì)胞）混合，其中與微球的外部表面連接的免疫原性表位或抗原、或表面或 其它標(biāo)志物是用于分離稀少細(xì)胞群體的相同表位或抗原； b) 向包含熱不穩(wěn)定性微球的細(xì)胞混合物中添加結(jié)合配偶體，所述結(jié)合配偶體與免疫原 性表位或抗原、或表面或其它標(biāo)志物結(jié)合；和 c) 從細(xì)胞混合物中并發(fā)地分離結(jié)合配偶體結(jié)合的微球和稀少細(xì)胞群體的細(xì)胞，其中捕 獲的微球的數(shù)量代表從細(xì)胞混合物中捕獲稀少細(xì)胞群體中的細(xì)胞的效率；由此示蹤從細(xì)胞 混合物中回收稀少細(xì)胞群體的效率。
[0008] 在另外的方面中，本發(fā)明提供了示蹤從細(xì)胞混合物中回收稀少細(xì)胞群體的效率和 回收基因組DNA的效率的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括： a) 將預(yù)定數(shù)量的上面和本文中描述的熱不穩(wěn)定性微球與細(xì)胞混合物(其被懷疑包含稀 少細(xì)胞群體的細(xì)胞）混合，其中與微球的外部表面連接的免疫原性表位或抗原、或表面或其 它標(biāo)志物是用于分離稀少細(xì)胞群體的相同表位或抗原； b) 向包含熱不穩(wěn)定性微球的細(xì)胞混合物中添加結(jié)合配偶體，所述結(jié)合配偶體與免疫原 性表位或抗原、或表面或其它標(biāo)志物結(jié)合； c) 從細(xì)胞混合物中并發(fā)地分離結(jié)合配偶體結(jié)合的微球和稀少細(xì)胞群體的細(xì)胞，其中捕 獲的微球的數(shù)量代表從細(xì)胞混合物中捕獲稀少細(xì)胞群體中的細(xì)胞的效率； d) 在并發(fā)地從細(xì)胞中釋放基因組DNA和從微球中釋放靶核酸的條件下，使分離的微球 和分離的稀少細(xì)胞群體中的細(xì)胞經(jīng)歷至少50°C的溫度；和 e) 并發(fā)地?cái)U(kuò)增和定量來自分離的細(xì)胞的基因組DNA和從熱不穩(wěn)定性微球中釋放的靶 核酸，其中擴(kuò)增的靶核酸的量代表從分離的稀少細(xì)胞群體的細(xì)胞中回收基因組DNA的效 率，由此示蹤從細(xì)胞混合物中回收稀少細(xì)胞群體的效率和回收基因組DNA的效率。
[0009] 在一些實(shí)施方案中，該方法另外包括： 在d)之前，通過詢問可檢測的標(biāo)記鑒定在C)期間分離的微球的數(shù)量；和 將鑒定的微球的數(shù)量與在a)中提供的預(yù)定數(shù)量相比較。在一些實(shí)施方案中，在稀少細(xì) 胞群體中的細(xì)胞是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，稀少細(xì)胞群體包括循環(huán)腫瘤 細(xì)胞（CTC)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞混合物在來自患者的生物樣本中。在一些實(shí)施方案 中，生物樣本是全血。在一些實(shí)施方案中，熱不穩(wěn)定性微球的預(yù)定數(shù)量在約10-約100個(gè)微 球的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，所述患者是人。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體(其與免 疫原性表位或抗原、或表面或其它標(biāo)志物結(jié)合）是抗體或抗體片段。
[0010] 在另外的方面中，提供了刺激敏感性微粒。在一些實(shí)施方案中，該微粒包含： i) 包含內(nèi)部空間和外部表面的殼，其中所述殼在內(nèi)部空間中包含一種或多種報(bào)告分 子，其中所述殼當(dāng)暴露于刺激時(shí)釋放所述一種或多種報(bào)告分子；和 ii) 與殼的外部表面連接的免疫原性表位。在不同的實(shí)施方案中，微粒是球狀的。在 一些實(shí)施方案中，微粒包含在約I Mm-約100 Mm的范圍內(nèi)的平均直徑，例如，在約I Mm-約 10 Mm的范圍內(nèi)的平均直徑，例如，在約10 Mm-約100 Mm的范圍內(nèi)的平均直徑。在不同 的實(shí)施方案中，刺激是溫度、pH、輻射、光和/或與酶接觸。在不同的實(shí)施方案中，殼包括一 種或多種聚合物、單層（unilamellar)膠束、雙層（bilamellar)膠束、樹狀聚體或樹狀體 (dendrosme )和/或碳納米管或由它們組成。在一些實(shí)施方案中，殼由pH敏感性樹狀聚體或 樹狀體、脂質(zhì)體或一種或多種聚合物組成。在一些實(shí)施方案中，殼是由溫度敏感性樹狀聚體 或樹狀體、脂質(zhì)體或聚合物組成。在不同的實(shí)施方案中，殼是由同聚物，例如，生物可降解的 聚酯組成。在一些實(shí)施方案中，同聚物含有明確的熔點(diǎn)并在大于約50°C的溫度下釋放核酸。 在一些實(shí)施方案中，同聚物選自聚己內(nèi)酯（PCL)、聚L-賴氨酸（PLL)、聚苯乙烯、聚異丁烯酸 甲酯（PMMA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA)、聚異丙基丙烯酰胺、丁基乙烯基醚、順式氯丁 二烯、己二酸乙二酯、氧化乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、乙基乙烯基醚、反式異戊二烯、聚（己烯 1)、聚（異丁烯酸甲酯）、聚（氯乙烯）、氧化丙烯、丙基乙烯基醚和乙烯基乙縮醛。在一些 實(shí)施方案中，同聚物是聚己內(nèi)酯（PCL)。在一些實(shí)施方案中，殼是由一種或多種共聚合物組 成。例如，在不同的實(shí)施方案中，殼包括N異丙基丙烯酰胺（NIPAAm)、丙基丙烯酸（PAA)和 丙烯酸丁酯（BA)。在一些實(shí)施方案中，殼包含羧甲基殼聚糖（CMCTS)和羧甲基殼聚糖-接 枝-聚（N，N-二乙基丙烯酰胺）（CMCTS-g-PDEA)。在一些實(shí)施方案中，殼包含三甲基-殼 聚糖（TMC)、聚（乙二醇）二甲基丙烯酸酯（PEGDM)和異丁烯酸（MA)。在一些實(shí)施方案 中，殼包含聚（N異丙基丙烯酰胺）（PNIPAM)和聚乙二醇（PEG)。在一些實(shí)施方案中，殼包 括聚（異丁烯酸（MAA)-乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDM)共聚物（P(MAA- C〇-EGDMA)或聚 (異丁烯酸（MAA)-乙二醇異丁烯酸酯（EGM)共聚物（P(MAA-co-EGMA)。在一些實(shí)施方案 中，殼包含水解的異丁烯酸化的明膠（HGel-MA)、N，N'亞甲基雙丙烯酰胺和N異丙基丙烯酰 胺。在一些實(shí)施方案中，殼包括藻酸1? (Ca-ALG)、藻酸-寡殼聚糖（ALGOCH)和藻酸-寡殼 聚糖-EUDRAGIT? L100-55 (ALG-OCH-EL)。在不同的實(shí)施方案中，殼是由樹狀聚體或樹狀體 組成。在一些實(shí)施方案中，樹狀體由高分枝的聚甘油、環(huán)糊精和雙鏈聚己內(nèi)酯（BPCL)組 成。在一些實(shí)施方案中，殼在小于約7或大于約8的pH下或在小于約20°C或大于約37°C 的溫度下釋放一種或多種報(bào)告分子。在一些實(shí)施方案中，殼由油酰胺衍生物組成。在不同 的實(shí)施方案中，一種或多種報(bào)告分子包括革G核酸。在一些實(shí)施方案中，革El核酸包括DNA。在 一些實(shí)施方案中，靶核酸包含于DNA質(zhì)粒中。在一些實(shí)施方案中，靶核酸編碼非人DNA序列 或突變的人DNA序列或人造的DNA序列。在一些實(shí)施方案中，一種或多種報(bào)告分子包括可 檢測的標(biāo)記。在不同的實(shí)施方案中，可檢測的標(biāo)記是熒光基團(tuán)。在不同的實(shí)施方案中，熒光 基團(tuán)包含約460 nm的激發(fā)峰和約500 nm的發(fā)射峰。在一些實(shí)施方案中，免疫原性表位或 抗原選自上皮細(xì)胞粘附分子（Ep-CAM)、洋地黃毒苷和生物素。
[0011] 在另一方面中，提供了示蹤從細(xì)胞混合物中回收稀少細(xì)胞群體的細(xì)胞的效率的方 法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括： a) 將上面和本文中描述的預(yù)定數(shù)量的微粒與細(xì)胞混合物(其被懷疑包含稀少細(xì)胞群體 的細(xì)胞）混合，其中與微粒外部表面連接的免疫原性表位或抗原是用于分離稀少細(xì)胞群體 的相同表位； b) 向包含微粒的細(xì)胞混合物中添加結(jié)合配偶體，所述結(jié)合配偶體與免疫原性表位結(jié) 合； c) 從細(xì)胞混合物中并發(fā)地分離結(jié)合配偶體結(jié)合的微粒和稀少細(xì)胞群體的細(xì)胞，其中捕 獲的微粒的數(shù)量代表從細(xì)胞混合物中捕獲稀少細(xì)胞群體中的細(xì)胞的效率； d) 使分離的微粒和分離的稀少細(xì)胞群體中的細(xì)胞經(jīng)歷并發(fā)地從細(xì)胞中釋放基因組 DNA和從微粒中釋放一種或多種報(bào)告分子的條件；和 e) 并發(fā)地定量來自分離的細(xì)胞的基因組DNA和從微粒中釋放的一種或多種報(bào)告分子， 其中一種或多種報(bào)告分子的量代表從分離的稀少細(xì)胞群體的細(xì)胞中回收基因組DNA的效 率，由此示蹤從細(xì)胞混合物中回收稀少細(xì)胞群體的效率。在一些實(shí)施方案中，該方法另外包 括：在d)之前，通過詢問一種或多種報(bào)告分子鑒定在c)期間分離的微粒的數(shù)量；并將鑒定 的微粒的數(shù)量與在a)中提供的預(yù)定的數(shù)量作比較。在不同的實(shí)施方案中，稀少細(xì)胞群體包 括真核細(xì)胞(例如，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC))。在不同的實(shí)施方案中，微粒包含與被示蹤、捕獲、 回收和處理的細(xì)胞接近或類似的大小和形狀。在不同的實(shí)施方案中，細(xì)胞混合物在來自患 者的生物樣本(例如，全血）中。在一些實(shí)施方案中，患者是人。在一些實(shí)施方案中，微粒的 預(yù)定數(shù)量在約10-約100個(gè)微粒的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體(其與免疫原性 表位或抗原結(jié)合)是抗體或抗體片段。在一些實(shí)施方案中，稀少細(xì)胞群體包括原核細(xì)胞。在 一些實(shí)施方案中，細(xì)胞混合物在水樣本中。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞混合物在食品樣本中。
[0012] 定義