脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及流感病毒抗原疫苗領(lǐng)域，特別涉及一種脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)中，用于治療流行性感冒的表位疫苗主要由化學(xué)合成，由于抗原表位僅 代表了蛋白抗原的一部分，很難像蛋白抗原疫苗一樣誘導(dǎo)出多種免疫反應(yīng)；且表位疫苗通 常是線性的，不具備抗原蛋白上抗原表位所具有的立體構(gòu)象。因而直接用表位肽免疫很難 引起較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。雖然通過表位肽與載體分子連接后可在短期內(nèi)誘導(dǎo)較好的免疫應(yīng) 答，但是很難保證其免疫應(yīng)答的特異性，且為達(dá)到較好的免疫效果，一方面所需免疫原劑量 大，另一方面需要聯(lián)合使用佐劑，使其進(jìn)一步臨床應(yīng)用受到很大限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)中表位疫苗難以誘導(dǎo)出多種免疫反 應(yīng)，且難以引起較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，臨床應(yīng)用受到限制等缺陷，提供一種脂質(zhì)體流感病毒抗原 疫苗及其制備方法。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0005] 本發(fā)明提供了一種脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗的制備方法，采用反相蒸發(fā)法，包括 以下步驟：
[0006] (1)流感病毒抗原疫苗原液的制備：
[0007] 取任意一種或多種流感病毒毒株，分別將所述流感病毒毒株接種于病毒培養(yǎng)基 上，在33°C~35°C的溫度下培養(yǎng)48~72小時后，獲得流感病毒體，經(jīng)甲醛滅活，超濾濃 縮、納米對撞機(jī)裂解病毒及柱層析純化后制成流感病毒抗原疫苗原液；
[0008] ⑵空脂質(zhì)體的制備：
[0009] 將磷脂、膽固醇以及抗氧化劑混合溶于有機(jī)溶劑中，減壓蒸發(fā)有機(jī)溶劑后，得到膜 狀的空脂質(zhì)體；
[0010] (3)單相分散體系的制備：
[0011] 向步驟（2)中獲得的空脂質(zhì)體中加入乙醚或與乙醚有相似溶解性和極性的有機(jī) 溶劑溶解膜狀空脂質(zhì)體形成雙相分散體系，然后加入堿性緩沖液，在水浴型超聲波處理器 上超聲至混合物形成單相分散體系；
[0012] (4)成溶膠體系的制備：
[0013] 將步驟（3)中獲得的混合物通過減壓蒸發(fā)去除乙醚至凝膠形成，然后繼續(xù)減壓蒸 發(fā)形成水性懸濁液即脂質(zhì)體懸液，繼續(xù)干燥去除乙醚，得到空脂質(zhì)體，然后加入步驟（1)獲 得的流感病毒抗原疫苗原液，獲得粗制脂質(zhì)體；
[0014] (5)高壓勻漿
[0015] 將步驟（4)獲得的粗制脂質(zhì)體高壓勻漿，除菌過濾即可。
[0016] 在本發(fā)明提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗的制備方法中，所述步驟（4)中流感抗 原疫苗原液在加入空脂質(zhì)體之前還包括以下步驟：向流感病毒抗原疫苗原液中加入細(xì)胞保 護(hù)劑。
[0017] 在本發(fā)明提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗的制備方法中，所述細(xì)胞保護(hù)劑為海藻 糖，并使海藻糖在流感病毒抗原疫苗原液中的濃度為1%。
[0018] 在本發(fā)明提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗的制備方法中，所述堿性緩沖液為磷酸 鹽緩沖液。
[0019] 在本發(fā)明提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗的制備方法中，所述流感病毒毒株包括 甲1型、甲3型及乙型流感病毒毒株；所述病毒培養(yǎng)基為5-10日齡健康雞胚。
[0020] 在本發(fā)明提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗的制備方法中，所述磷脂包括大豆卵磷 月旨、卵磷脂、豆磷脂、腦磷脂、鞘髓磷脂、二鯨蠟磷酸酯中的一種或多種；
[0021] 所述有機(jī)溶劑為三氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮溶液中的一種或多種；
[0022] 所述抗氧化劑為維生素 E、維生素 C、維生素 A、類胡蘿卜素中的一種或多種。
[0023] 在本發(fā)明提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗的制備方法中，所述空脂質(zhì)體的制備過 程為：
[0024] 將大豆卵磷脂、維生素 E、膽固醇分別按摩爾比（4-6) :1 : (2-4)混合溶于100mL三 氯甲烷中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的茄型瓶中，在60°C-KKTC條件下水浴，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，成 膜，獲得膜狀空脂質(zhì)體。
[0025] 在本發(fā)明提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗的制備方法中，取300mg注射用大豆卵 磷脂、150mg膽固醇、50mg維生素 E混合溶于100mL三氯甲烷中，將該液體置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 的茄型瓶中，60°C水浴作為蒸發(fā)溫度，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，獲得膜狀空脂質(zhì)體。
[0026] 在本發(fā)明提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗的制備方法中，所述高壓勻漿過程為： 將粗制脂質(zhì)體用高壓勻漿機(jī)在壓力為15Kpa-30Kpa壓力范圍內(nèi)，勻質(zhì)5個循環(huán)，將脂質(zhì)體顆 粒粒徑勾質(zhì)至200-400nm，除菌過濾。
[0027] 本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)根據(jù)上述提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗的制備方法所獲得 脂質(zhì)體疫苗。
[0028] 實施本發(fā)明提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗及其制備方法，可以達(dá)到以下有益效 果：相對于線性的表位疫苗，具有立體抗原表位的脂質(zhì)體疫苗不僅可以同時攜帶多個或多 種抗原，誘發(fā)多種細(xì)胞免疫反應(yīng)并引起較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，而且脂質(zhì)體疫苗性能較穩(wěn)定，保存 期較長，同時，可減少免疫原劑量的使用量。
【附圖說明】
[0029] 下面將結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0030] 圖1為采用發(fā)明提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗進(jìn)行免疫的血清對H3N2病毒株 的標(biāo)準(zhǔn)抗原的ELISA檢測；
[0031] 圖2為采用發(fā)明提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗進(jìn)行免疫的血清對HlNl病毒株 的標(biāo)準(zhǔn)抗原的ELISA檢測；
[0032] 圖3為采用發(fā)明提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗進(jìn)行免疫的血清對B型病毒株的 標(biāo)準(zhǔn)抗原的ELISA檢測。
【具體實施方式】
[0033] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0034] 下述實施例中所述的實驗方法，若無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述的生物材料， 若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0035] 本發(fā)明提供的脂質(zhì)體流感病毒抗原疫苗采用反相蒸發(fā)法進(jìn)行制備，包括以下步 驟：
[0036] (1)流感病毒抗原疫苗原液的制備：
[0037] 取任意一種或多種流感病毒毒株，分別將所述流感病毒毒株接種于病毒培養(yǎng)基 上，在33°C~35°C的溫度下培養(yǎng)48~72小時后，獲得流感病毒體，經(jīng)甲醛滅活，超濾濃 縮、納米對撞機(jī)裂解病毒及柱層析純化后制成流感病毒抗原疫苗原液；
[0038] 其中，流感病毒毒株包括甲1型（HlNl)、甲3型（H3N2)及乙型三種目前最普遍的 流感病毒毒株，使得流感病毒抗原疫苗原液更具實用性；
[0039] (2)空脂質(zhì)體的制備：
[0040] 將磷脂、膽固醇以及抗氧化劑混合溶于有機(jī)溶劑中，減壓蒸發(fā)第一有機(jī)溶劑后，得 到膜狀的空脂質(zhì)體；
[0041] 其中，磷脂包括大豆卵磷脂、卵磷脂、豆磷脂、腦磷脂、鞘髓磷脂、二鯨蠟磷酸酯中 的一種或多種；
[0042] 有機(jī)溶劑為三氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮溶液中的一種或多種；
[0043] 抗氧化劑為維生素 E、維生素 C、維生素 A、類胡蘿卜素中的一種或多種；磷脂、抗氧 化劑、有機(jī)溶劑按摩爾比為（4-6) :1 :(2-4)混合溶于100mL有機(jī)溶劑中；
[0044] (3)單相分散體系的制備：
[0045] 向步驟（2)中獲得的空脂質(zhì)體中加入乙醚或與乙醚有相似溶解性和極性的有機(jī) 溶劑溶解膜狀空脂質(zhì)體形成雙相分散體系，然后加入堿性緩沖液，在水浴型超聲波處理器 上超聲至混合物形成單相分散體系；
[0046] 其中，堿性緩沖液pH值為7. 2，堿性緩沖液可以為磷酸鹽緩沖液等；
[0047] (4)成溶膠體系的制備：
[0048] 將步驟（3)中獲得的混合物通過減壓蒸發(fā)去除乙醚至凝膠形成，然后繼續(xù)減壓蒸 發(fā)形成水性懸濁液即脂質(zhì)體懸液，繼續(xù)干燥去除乙醚，得到空脂質(zhì)體，然后加入步驟（1)獲 得的流感病毒抗原疫苗原液，獲得粗制脂質(zhì)體；