人β防御素4用于制備治療喉癌藥物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及人β防御素4的新應(yīng)用，具體涉及人β防御素4用于制備治療喉癌 藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人β防御素4 (HBD4)是2001年Jose-Ramon對(duì)人染色體8ρ23的基因序列圖譜分 析時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新型β防御素。HBD4表達(dá)于睪丸、胃竇、子宮等各種粘膜細(xì)胞和上皮組織， 與HBD3、溶菌酶有協(xié)同作用，是單核細(xì)胞的趨化物?，F(xiàn)有技術(shù)研宄表明，HBD4對(duì)多種細(xì)菌具 有殺傷作用，特別是綠膿桿菌殺傷作用更強(qiáng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明一方面的目的是提供人β防御素4用于制備治療喉癌藥物的應(yīng)用。
[0004] 發(fā)明人研宄發(fā)現(xiàn)人β防御素4(HBD4)對(duì)人喉癌上皮細(xì)胞細(xì)胞具有殺傷作用，并且 其殺傷作用具有時(shí)間和劑量依賴性，并且HBD4選擇性腫瘤細(xì)胞膜穿透作用是其主要抗腫 瘤作用機(jī)制。
【附圖說(shuō)明】
[0005] 圖I (a)為對(duì)照組H印2細(xì)胞X 2000,圖I (b)為HBD4作用的H印2細(xì)胞X 2000。
【具體實(shí)施方式】
[0006]目前國(guó)內(nèi)外主要用人工合成方法獲得HBD4,或用原核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)HBD4,證實(shí) 其具有強(qiáng)烈的抗菌活性。但是，關(guān)于HBD4是否有抗腫瘤作用，其抗腫瘤機(jī)制如何。發(fā)明人 進(jìn)行了 HBD4對(duì)人喉癌上皮細(xì)胞（Hep2)的殺傷作用及其作用機(jī)制的研宄。
[0007] 發(fā)明人將通過(guò)基因工程方法表達(dá)并純化獲得的HBD4作用于H印2細(xì)胞，根據(jù)HBD4 終濃度將H印2細(xì)胞分為A、B、C、D四組，濃度分別為0 μ g. L-1 (對(duì)照組）、20 μ g. L'40 μ g. L'100 μ g. ΙΛ根據(jù)HBD4作用時(shí)間又分為I、II、III三組，時(shí)間分別為6、12、24h。倒置相差 顯微鏡下觀察H印2細(xì)胞形態(tài)，噻唑藍(lán)（MTT)法測(cè)定HBD4對(duì)H印2細(xì)胞的殺傷作用，掃描電 鏡觀察其細(xì)胞表面變化。具體實(shí)驗(yàn)材料、方法及結(jié)果如下：
[0008] 1、材料：
[0009] HBD4由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。
[0010] HBD4的表達(dá)和純化：采用基因工程的方法，在大腸桿菌中表達(dá)HBD4融合蛋白，親 和層析純化，獲得HBD4蛋白。重組蛋白凍干保存，使用前用滅菌生理鹽水溶解成lmg/L濃 縮液備用。
[0011] ifep-2細(xì)胞細(xì)胞系為上海研晶生物科技有限公司產(chǎn)品。
[0012] 2、方法：
[0013] (1)細(xì)胞培養(yǎng)和噻唑藍(lán)（MTT)測(cè)定HBD4對(duì)H印2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
[0014] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H印2細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為I X 107?Λ接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每 孔接種200 μL，置SYOjOmL.r1二氧化碳（CO2)孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜，次日加入HBD4,根據(jù)其 終濃度將H印2細(xì)胞分為A、B、C、D 4組，濃度分別為0 μ g. L-1 (對(duì)照組）、20 μ g. L'40 μ g. L \ 100 Ug-L10
[0015] 根據(jù)HBD4作用時(shí)間又將H印2細(xì)胞分為I、II、III 3組，作用時(shí)間分別為6h、12h、 24h，每一濃度對(duì)應(yīng)的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均做4個(gè)復(fù)孔，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。37°C孵 箱中培養(yǎng)到相應(yīng)時(shí)間后，每孔加入MTT溶液[2g. Γ1磷酸鹽緩沖液（PBS) ] 50 μ L，37°C孵育 4h，棄上清，每孔加入二甲亞砜150 μ L，振蕩后測(cè)每孔A49tlnm值，計(jì)算殺傷率：殺傷率=(處 理孔 A49tlm/對(duì)照孔 A49tlJ X 100 %。
[0016] H印2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：
[0017] 正常生長(zhǎng)的ifep2細(xì)胞呈梭形或多角形，有較長(zhǎng)的突起，呈單層貼壁，生長(zhǎng)迅速，代 謝旺盛，48h須換液一次，3-4d傳代1次。對(duì)照組細(xì)胞大小、形態(tài)不規(guī)則，但差異不大，折光 性好，邊緣清晰，內(nèi)含豐富顆粒。HBD4處理6h后細(xì)胞大小、形態(tài)和貼壁能力較對(duì)照組有明顯 差別：B組細(xì)胞形態(tài)變化不大，貼壁尚可；C組細(xì)胞明顯皺縮，突起少見(jiàn)，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞 內(nèi)顆粒顏色加深，折光性增強(qiáng)，大量細(xì)胞呈片狀脫落，培養(yǎng)液中有多量細(xì)胞漂浮，細(xì)胞生長(zhǎng) 明顯減緩。D組作用12h后，大部分腫瘤細(xì)胞死亡。
[0018] MTT法結(jié)果顯示：
[0019] D組隨著HBD4作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)減少，差異顯著（P〈0. 05) ; I、II、111組：隨 HBD4濃度增加，細(xì)胞數(shù)均減少，差異顯著（Ρ〈0. 01)，提示HBD4對(duì)H印2細(xì)胞的殺傷作用具有 時(shí)間和劑量依賴性，見(jiàn)表1。
[0020] 表1不同濃度的HBD4作用H印2細(xì)胞不同時(shí)間后的A值
[0022] 注：D 組，III和 I 比較，*Ρ〈0. 05
[0023] I 組，A 和 D 比較，#Ρ〈0· 01 ;Β 和 D 比較，#Ρ〈0· 05
[0024] II組，C 和 A、D 和 B 比較，ΔΡ〈〇·〇5 ;D 和 A 比較，ΔΡ〈〇·〇1，
[0025] III組，B 和 D、B 和 A 比較，?Ρ〈0·05 ;C 和 A、D 和 A 比較，?Ρ〈0·01
[0026] (2)掃描電鏡的制樣及HBD4對(duì)H印2細(xì)胞殺傷作用的觀察
[0027] 常規(guī)培養(yǎng)H印2細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用新鮮培養(yǎng)液配制成活細(xì)胞數(shù)為I X 108ΙΛ 接種到96孔培養(yǎng)板上，每孔200 μ L，培養(yǎng)到細(xì)胞數(shù)為I X IO9L'加入HBD4,調(diào)節(jié)其濃度為 40 μ g. ΙΛ置37°C、50mL. ΙΛΧ)2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h，1000 r. mirT1離心10min，棄上清液，加 入戊二醛固定，〇. lmol. T1PBS換洗三次，IOg. Γ1鋨酸固定，清洗，常規(guī)梯度脫水，置換，臨界 點(diǎn)干燥，離子派射鍍膜，掃描電鏡觀察。
[0028] HBD4作用于H印2細(xì)胞后的電鏡觀察結(jié)果：
[0029] 體外培養(yǎng)的H印2細(xì)胞經(jīng)HBD4作用12h，細(xì)胞表面正常的微絨毛消失，出現(xiàn)散在的 不規(guī)則的孔洞，細(xì)胞膜骨架嚴(yán)重破壞，細(xì)胞內(nèi)容物大量外泄，至細(xì)胞徹底死亡，見(jiàn)圖I (a)。而 未經(jīng)HBD4處理的對(duì)照組腫瘤細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整無(wú)破損，表面具有微絨毛，見(jiàn)圖I (b)。
[0030] 經(jīng)過(guò)上述實(shí)驗(yàn)研宄，發(fā)明人證實(shí)HBD4對(duì)H印2細(xì)胞具有殺傷作用，并且其殺傷作用 具有時(shí)間和劑量依賴性。同時(shí)揭示了 HBD4抗腫瘤作用機(jī)制：HBD4選擇性腫瘤細(xì)胞膜穿透 作用是其主要抗腫瘤作用機(jī)制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.人0防御素4用于制備治療喉癌藥物的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及人β防御素4用于制備治療喉癌藥物的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)人β防御素4對(duì)人喉癌上皮細(xì)胞細(xì)胞具有殺傷作用，并且其殺傷作用具有時(shí)間和劑量依賴性，并且HBD4選擇性腫瘤細(xì)胞膜穿透作用是其主要抗腫瘤作用機(jī)制。
【IPC分類】A61K38/17, A61P35/00
【公開(kāi)號(hào)】CN104984320
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510437446
【發(fā)明人】曹玉紅, 張光運(yùn), 曹開(kāi)方
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年7月23日