一種近紅外激光觸發(fā)的復(fù)合納米制劑的制備方法
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種近紅外激光觸發(fā)的復(fù)合納米制劑的制備方法。
[0002]
【背景技術(shù)】： C6tl，具有獨特大?。ㄖ睆郊s為0. 71 nm)與中空球形32面體結(jié)構(gòu)，其外表面分布著30 個π電子組成的大π鍵，易于修飾，含有π電子的分子可通過π電子堆積吸附在C6tl表 面。C6tl上連接一種造影劑后，表面仍存在π電子，對含π電子的化合物依然具有較強作 用力。利用這種特性，可以構(gòu)建一種近紅外激光觸發(fā)的復(fù)合納米制劑。同時，C 6tl在可見光 照射下產(chǎn)生氧自由基、切割DNA的作用，表現(xiàn)出顯著的細胞毒特性，且光毒性隨照射時間和 C6tl濃度增加而增強，表明C6tl可作為光敏劑用于腫瘤治療。
[0003] 上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs)是一類利用近紅外光（通常為980nm)激發(fā)、短波長發(fā) 射的熒光材料，能克服有機染料光學(xué)穩(wěn)定性差，半導(dǎo)體量子點易引發(fā)較強背景熒光的缺點 而備受關(guān)注，將其應(yīng)用在生物標(biāo)記領(lǐng)域時，具有窄帶發(fā)射，較大的反斯托克斯位移，較深的 組織穿透深度和空間分辨率，對組織的損傷較小且不會產(chǎn)生自發(fā)熒光等優(yōu)點，核殼式上轉(zhuǎn) 換熒光材料的熒光靈敏度更高。
[0004] 超順磁性氧化鐵納米顆粒作為一種新型磁共振T2場成像對比劑，可用于選擇性 增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的磁共振成像，對腫瘤病變的成像效果好，能提高圖像的清晰度，安全性 高，在癌癥的早期診斷中具有重要意義。IOOnm以下的磁性材料進入體內(nèi)后可選擇性濃集 于靶器官并滯留一段時間，使成像組織的弛豫速率比背景部位改變更大，提高磁共振成像 (MRI)診斷的效果。在C 6tl表面通過化學(xué)修飾，連接上轉(zhuǎn)換納米熒光劑和超順磁性氧化鐵納 米粒，并荷載化療藥物DTX，可構(gòu)建具有磁靶向性的光/磁雙模態(tài)成像診斷治療藥物。
[0005] 聚合物膠束的臨界膠束濃度低，解離速度慢，能實現(xiàn)體內(nèi)長循環(huán)，同時可包載難溶 性藥物并具有較高的載藥量，常作為藥物控釋、靶向給藥系統(tǒng)的載體使用。近年來，光敏膠 束因其能在光照條件下，可控制藥物的釋放，提高治療效果而被視為一種具有應(yīng)用前景的 新型藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，在醫(yī)藥領(lǐng)域得到越來越廣泛的重視。然而，紫外光照射對組織的損傷， 限制了光敏膠束在制劑中的應(yīng)用，而C 6tl雖可在可見光照射下產(chǎn)生活性氧，從而殺死腫瘤細 胞，但因可見光的穿透性差而使其應(yīng)用受限。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的就是提供一種近紅外激光觸發(fā) 的復(fù)合納米制劑的制備方法，利用近紅外980nm激光照射該納米制劑，借助其中上轉(zhuǎn)換納 米粒的發(fā)射光觸發(fā)光敏膠束釋放藥物，達到診斷治療的目的，解決可見光穿透能力差，診斷 治療二次服藥的問題； 本發(fā)明解決的技術(shù)方案是采用近紅外光980nm激光照射深層組織，使C6tl產(chǎn)生活性氧， 避免紫外光照射引起膠束破膜釋藥對組織造成的損傷，對腫瘤的治療更加精準(zhǔn)，安全，有 效。據(jù)此本發(fā)明解決的技術(shù)方案，包括以下步驟： (1)將C6tl進行磁性修飾，形成C ^rFe3O4，所述的四氧化三鐵和C6tl的重量比為（1-10 ): 1， 方法是：將50mg C6tl溶于50ml甲苯，加0. 5g氫化鈉，超聲溶解，加入0. 1-0. 5ml溴代丙二酸 二乙酯，15-25°〇在隊保護下攪拌5h，過濾除去氫化鈉，旋蒸除去甲苯，真空干燥12h，得C6tl 丙二酸酯衍生物，將C6tl丙二酸酯衍生物溶于30ml甲苯中，加入380mg氫化鈉，80 °C在N 2保 護下油浴反應(yīng)l〇h(即甲苯相無色);除去甲苯，加20ml濃鹽酸過濾，得濾餅，將濾餅溶于50ml 甲醇中，過濾除去甲醇不溶物，旋蒸除去甲醇，50°C真空干燥得丙二酸取代的C6tl-COOH; 將C6(l-C00H50mg溶解于IOml由乙二醇和二縮醇體積比1:19構(gòu)成的混合溶劑中，加入 醋酸鈉0. 75g，三價鐵0. 27g，超聲溶解，然后將所得溶液，200°C反應(yīng)10h，冷至室溫，反應(yīng)產(chǎn) 物依次用無水乙醇洗滌3次，水洗3次，真空干燥，得四氧化三鐵負(fù)載的C 6tl (C6tl-Fe3O4)(可 直接采用專利申請?zhí)枮?01310138295. 4的"一種磁性水溶性富勒烯及其制備方法和應(yīng)用" 中的方法對C6tl進行磁性修飾，形成C 6(l-Fe304)，所述的三價鐵為氯化鐵、溴化鐵、高氯酸鐵、 硝酸鐵、硫酸鐵、硫化鐵、磷酸鐵中的任意一種； (2) 氨基化核殼式上轉(zhuǎn)換熒光材料（UCNPs-NH2)的合成：將0. 10-0. 50g的基質(zhì)材料 A，0. 05-0.1 Og的敏化劑B和0. 02-0.1 Og的激活劑C置于50ml三口燒瓶中，加5-10ml油 酸，5-15ml十八碳烯，先升溫到160°C，保持30分鐘，待其降至室溫后，將含有0.1 OgNaOH, 0. 15g氟化物的甲醇溶液加入上述溶液中，20-50°C反應(yīng)30分鐘，除去甲醇，200-320°C反應(yīng) l-5h，冷至室溫后，加丙酮20ml，12000r/min離心10分鐘，沉淀用無水乙醇洗3次，最后沉 淀重新分散于正己烷中，即得NaAF 4: Ln3+上轉(zhuǎn)換材料，以其為內(nèi)核，按上述制備NaAF 4: Ln3+ 方法再合成外層上轉(zhuǎn)換材料，得核殼式上轉(zhuǎn)換熒光材料；所述的基質(zhì)材料A，為稀土氯化物 YCl3 · 6H20, GdCl3 · 6H20或稀土氧化物Y203, Gd2O3的一種；所述的敏化劑B，為稀土氯化物 YbCl3 · 6H20或稀土氧化物Yb2O3的一種；所述的激活劑C，為ErCl 3 · 6H20或TmCl3 · 6H20的 一種；所述的氟化物，為NH4F、NaF、CaF^ MgF 2的一種； 將0.02g核殼式上轉(zhuǎn)換熒光材料，溶于70ml乙醇中，超聲溶解，35°C水浴，加體積濃度 為15%的NH3 ·Η20 IOml攪拌10分鐘，加正硅酸乙酯40 μ 1，攪拌2h，然后加3-氨丙基三乙 氧基硅烷0. 2ml，攪拌4h，12000r/min離心，用無水乙醇和水分別洗3次，沉淀真空干燥，即 得氨基化核殼式上轉(zhuǎn)換熒光材料（UCNP s-NH2); (3) C6tl上負(fù)載光/磁成像對比劑：按重量比C 6(l-Fe304:UCNPS-NH2=lg : (1-10) g，溶于 IOml水中，加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)0.0 10g，N-羥基琥珀 酰亞胺（NHS) 0.0 lg，室溫反應(yīng)8-24h，收集反應(yīng)產(chǎn)物，干燥，得C6tl上負(fù)載光/磁成像對比劑 (C60/Fe 304-UCNPs)； (4) 光敏殼聚糖膠束的合成：Ig殼聚糖溶于100mL醋酸-甲醇溶液中，醋酸與甲醇的體 積比為1:1，然后加入質(zhì)量濃度為15%的丁二酸酐丙酮溶液20ml，攪拌8-48h，用質(zhì)量濃度 5%的NaOH溶液調(diào)pH至10,過濾，濾液用無水乙醇重結(jié)晶，離心，沉淀真空干燥，得N-琥珀 酰殼聚糖； 稱取Ig鄰硝基苯甲醇和〇. 8g 丁二酸酐溶于IOml吡啶中，50°C水浴反應(yīng)24h，將反應(yīng) 產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取(得酯層)，酯層依次用水、飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，然后棄去乙酸乙酯 層(得水層)，水層加入體積濃度為10%的鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH=5,得沉淀，沉淀物真空干燥，得 N-琥珀酰鄰硝基苯甲醇； 稱取0. 2g N-琥珀酰鄰硝基苯甲醇，加 EDC和NHS，三者重量比為5:2:1，以二甲基甲酰 胺為溶劑溶解，室溫反應(yīng)24h，成反應(yīng)混合溶液，然后取0. SgN-琥珀酰殼聚糖溶解于20ml超 純水，逐滴加入上述溶液中，避光反應(yīng)24h，反應(yīng)產(chǎn)物用分子量為8000-12000的透析袋透析 3天，冷凍干燥，得光敏殼聚糖膠束（SNSC); (5)制備近紅外激光觸發(fā)的復(fù)合納米制劑：取0. 05gC6(l/Fe304-UCNPS，0.0 lg多西他賽溶 于IOml超純水中，超聲2h，然后加入0. 05gSNSC，室溫攪拌12h，離心，得沉淀，沉淀用pH值 為 7. 2-7. 4 的 PBS 復(fù)溶，得復(fù)合納米制劑（SNSC@C6(l/Fe304-UCNPs/DTX)。
[0007] 本發(fā)明制備的SNSC@C6Q/Fe304-UCNPs/DTX復(fù)合納米制劑可在近紅外光980nm照射 下，定時定位釋藥，同時能使C 6tl在較深的組織內(nèi)產(chǎn)生活性氧，協(xié)同化療殺死腫瘤細胞，結(jié)合 熒光成像和磁共振成像，實現(xiàn)診斷治療一體化，避免二次服藥的問題，原料來源豐富，成本 低，使用效果好，有巨大的經(jīng)濟和社會效益。
[0008]
【具體實施方式】： 以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。
[0009] 本發(fā)明在具體實施中可由以下實施例給出： 實施例1 本發(fā)明在具體實施中，所述的一種近紅外激光觸發(fā)的復(fù)合納米制劑的制備方法，由以 下步驟實現(xiàn)： (1) 將C60進行磁性修飾，形成C60-Fe3O4,方法如下：50mg C60溶于50ml甲苯，加0· 5g氫 化鈉，超聲使其完全溶解，加入〇. Iml溴代丙二酸二乙酯，15°C N2保護下，攪拌5h，過濾除 去氫化鈉，旋蒸除去甲苯，真空干燥12h，得C6tl丙二酸酯衍生物；將C 6(|丙二酸酯衍生物溶 于30ml甲苯中，加入380mg氫化鈉，80°C，N2保護下，油浴反應(yīng)IOh ;除去甲苯，加20ml濃鹽 酸，過濾，得濾餅，將濾餅溶于50ml甲醇中，過濾除去甲醇不溶物，旋蒸除去甲醇，50°C真空 干燥得丙二酸取代的C 6tl-COOH ; 稱取C6(l-C00H50mg溶解于IOmL由乙二醇和二縮醇組成的混合溶劑中，乙二醇和二縮醇 的體積比為1:19,加入醋酸鈉0. 75g，三氯化鐵0. 27g，超聲溶解，然后將所得溶液轉(zhuǎn)移至反 應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)10h，冷至室溫，反應(yīng)產(chǎn)物分別用無水乙醇洗絳3次，水洗3次，真空干燥， 得負(fù)載四氧化三鐵的C 6Q (C6tl-Fe3O4); (2) 氨基化核殼式上轉(zhuǎn)換熒光材料（UCNPs-NH2)的合成：將0.1 Og的YCl3 · 6H20,0. 05g 的YbCl3 · 6H20和0· 07g的ErCl3 · 6H20置于50ml三口燒瓶中，加5ml油酸，5ml十八碳 烯，先升溫到160°C，保持30分鐘，降至室溫，得混合溶液，將含有0. 10gNa0H，0. 15gNH4F的 甲醇溶液加混合溶液中，在20°C反應(yīng)30分鐘，除去甲醇，200°C反應(yīng)lh，冷至室溫，加丙酮 20ml，12000r/min離心10分鐘，得沉淀，沉淀用無水乙醇洗3次，再重新分散于正己烷中，得 NaYF4: Yb, Er上轉(zhuǎn)換材料；以NaYF4: Yb, Er上轉(zhuǎn)換材料為內(nèi)核，按上述制備NaYF4: Yb, Er方法 再合成外層上轉(zhuǎn)換材料，得核殼式上轉(zhuǎn)換熒光材料； 稱取0.02g上述核殼式上轉(zhuǎn)換熒光材料，溶于70ml乙醇中，超聲使其完全溶解，置于 35°C水浴中，加體積濃度為15%的NH3 · H2O IOml攪拌10分鐘，加正硅酸乙酯40 μ 1，攪拌 2h，然后加3-氨丙基三乙氧基硅烷0. 2ml，攪拌4h，12000r/min離心，用無水乙醇和水分別 洗3次，沉淀真空干燥，即得氨基化核殼式上轉(zhuǎn)換熒光材料； (3) C6tl上負(fù)載光/磁成像對比劑：將IgC 6Q-Fe304和IgUCNPs-NH2，溶于IOml水中，取 EDC0.0 10g，NHSO. Olg，室溫反應(yīng) 8h，磁鐵收集產(chǎn)物，干燥，得 C6tZFe3O4-UCNPs ; (4) 光敏殼聚糖膠束的合成：Ig殼聚糖溶于100mL醋酸-甲醇溶液中，醋酸與甲醇的體 積比為1: 1，然后滴加質(zhì)量濃度15%的丁二酸酐丙酮溶液20ml，攪拌8h，用質(zhì)量濃度5%Na0H 溶液調(diào)pH至10,過濾，濾液用無水乙醇重結(jié)晶，離心，得沉淀，沉淀真空干燥，得N-琥珀酰殼 聚糖； 稱取Ig鄰硝基苯甲醇和〇. 8g 丁二酸酐溶于IOml吡啶中，50°C水浴反應(yīng)24h，將產(chǎn)物 用乙酸乙酯萃取，酯層依次用水、飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，然后棄去乙酸乙酯層，水層加入 體積濃度為10%鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH=5,沉淀真空干燥，得N-琥珀酰鄰硝基苯甲醇； 稱取0. 2g N-琥珀酰鄰硝基苯甲醇和EDC、NHS混合在一起，三者重量比為5:2:1，用二 甲基甲酰胺溶解，室溫反應(yīng)24h，然后取0. 8gN-琥珀酰殼聚糖溶解于20ml超純水，逐滴加 入上述溶液中，避光反應(yīng)24h，反應(yīng)產(chǎn)物用分子量為8000-12000的透析袋透析3天，冷凍干 燥，得光敏殼聚糖膠束（SNSC); (5)近紅外激光觸發(fā)的復(fù)合納米制劑的制備：取0. 05gC6(l/Fe304-UCNPs，0.0 lg多西他 賽溶于IOml超純水中，超聲2h，然后加入0.05gSNSC，室溫攪拌12h，離心，沉淀用pH為 7. 2-7. 4 的 PBS 復(fù)溶，得 SNSC@C6Q/Fe304-UCNPs/DTX 復(fù)合納米制劑。
[0010] 實施例2 本發(fā)明在具體實施中，所述的一種近紅外激光觸發(fā)的復(fù)合納米診療劑的制備方法，由 以下步驟實現(xiàn)： (1) 將C6tl進行磁性修飾，形成C J5tl-Fe3O4，方法是：50mg C6tl溶于50ml甲苯，加0. 5g氫 化鈉，超聲溶解，加入〇. 2ml溴代丙二酸二乙酯，201在N2保護下攪拌5h，過濾除氫化鈉，旋 蒸除甲苯，真空干燥12h，得C 6tl丙二酸酯衍生物；將衍生物C6tl丙二酸酯衍生物溶于30ml甲 苯，加入380mg氫化鈉，80°C在隊保護下油浴反應(yīng)IOh ;除去甲苯，加20ml濃鹽酸過濾，得