一種組織工程人工皮膚及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程生物醫(yī)用材料和醫(yī)療器械領(lǐng)域，涉及一種組織工程人工皮膚及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]皮膚人體面積最大也是最重要的器官之一，具有呼吸、保持水分和生物屏障功能，但是由于燙傷、感染、摩擦等各種原因造成的皮膚缺損成為常見(jiàn)疾患之一，如何能夠開(kāi)發(fā)出一款替代人體皮膚的組織工程皮膚成為研宄的熱點(diǎn)。皮膚缺損成為組織工程皮膚的研宄范圍包括人工表皮、人工真皮和全層皮膚三個(gè)方面。其中，最受人們推崇的是同時(shí)含有真皮和表皮兩種結(jié)構(gòu)的人工皮膚(引自:人全層組織工程皮膚的研制，金巖等)。
[0003]為了解決皮膚缺損問(wèn)題，美國(guó)已開(kāi)發(fā)出數(shù)十種皮膚替代材料，包括有同種異體皮膚、異種皮膚、無(wú)細(xì)胞皮膚組織工程支架和人工合成材料皮膚。同種異體皮膚有AllopatchHD ?、Alloskin ?、Dermacell?等十余種，無(wú)細(xì)胞組織工程支架包括有Collaguard?、Integra "等多種皮膚替代材料，這些材料都存在免疫排斥或者需要再次植皮等問(wèn)題。
[0004]我國(guó)在皮膚缺損治療領(lǐng)域的發(fā)展較晚，經(jīng)過(guò)近十年來(lái)的發(fā)展，有部分產(chǎn)品已經(jīng)上市，如第四軍醫(yī)大學(xué)金巖教授開(kāi)發(fā)的含人體表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的人工皮膚，也有部分產(chǎn)品進(jìn)入開(kāi)發(fā)應(yīng)用階段。劉永慶開(kāi)發(fā)了一種人工皮膚的制備方法(專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)CN1485099A)，制備一種含表皮層和真皮層的人工皮膚，但該皮膚存在表皮層和真皮層易分離和無(wú)法耐受手術(shù)縫合的問(wèn)題。佘振定開(kāi)發(fā)了一種生長(zhǎng)因子緩釋型雙層人工皮膚(專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為CN101716376A)，高長(zhǎng)友等開(kāi)發(fā)的膠原-殼聚糖和硅橡膠雙層皮膚再生支架及其制備方法(公開(kāi)號(hào)CN1785444A)等也都存在表皮層與人體皮膚力學(xué)性能不匹配和需要二次植皮的問(wèn)題。
[0005]為了克服現(xiàn)有人工皮膚的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種最接近人體皮膚組織的組織工程人工皮膚支架材料，作為缺損皮膚的永久性皮膚替代物，去除了人工皮膚在應(yīng)用時(shí)的免疫排斥、異物反應(yīng)和病毒感染等方面的問(wèn)題。本發(fā)明所構(gòu)建的組織工程人工皮膚接近生理狀況，不僅可以同時(shí)將所缺損的表皮和真皮修復(fù)，而且這兩種成分具有互相影響的機(jī)制，促進(jìn)彼此的分化，比單純的人工表皮或是人工真皮更能達(dá)到滿(mǎn)意的效果，還可以作為載藥和干細(xì)胞領(lǐng)域的支架載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有產(chǎn)品的缺陷，目的在于提供一種新型組織工程人工皮膚及其制備方法，該人工皮膚具有表皮層和真皮層結(jié)構(gòu)，表皮層接近于人體皮膚，既能夠保持水分，又具有透氣透濕等呼吸功能，具有力學(xué)強(qiáng)度接近人體表皮層，可以耐受手術(shù)縫合操作，真皮層更加接近人體皮膚真皮層的結(jié)構(gòu)，為具有兩層不同孔隙率的三維多孔支架結(jié)構(gòu)組成，兩層因?yàn)榭紫堵什煌纬蓛蓚€(gè)層次的梯度結(jié)構(gòu)，這種高度仿生的結(jié)構(gòu)更加有利于真皮再生。
[0007]一種組織工程人工皮膚，包括表皮層和真皮層，其特征在于:所述的表皮層由致密的、帶有微孔結(jié)構(gòu)的內(nèi)部分子取向的半滲透性的薄膜組成，厚度為0.05~1_，所述的真皮層由兩層不同孔隙率的三維多孔支架結(jié)構(gòu)組成，其中所述兩層中的一層被交聯(lián)，兩層因?yàn)榭紫堵什煌纬蓛蓚€(gè)層次的梯度結(jié)構(gòu)，厚度為1.5~8_，該人工皮膚可賦予呼吸功能。
[0008]其中，組成表皮層的材料為膠原蛋白或膠原蛋白與殼聚糖的共混材料，組成真皮層的材料為膠原材料或膠原蛋白與殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、海藻酸鹽或聚乙烯醇的共混材料。
[0009]其中，所述膠原蛋白為無(wú)端肽膠原蛋白。
[0010]其中，組成的表皮層材料在微觀結(jié)構(gòu)上是分子取向的，可以接受手術(shù)中的縫合操作，厚度為0.05~lmmo
[0011]所述的真皮層由兩層不同孔隙率的三維多孔支架結(jié)構(gòu)組成，真皮層厚度為
1.5mm~8mm，其中貼近表皮層的上層多孔支架的孔隙率較低，為70~90%，貼近人體組織的下層多孔支架的孔隙率較高，為90~98% ;貼近人體組織的下層多孔支架材料為交聯(lián)結(jié)構(gòu)。
[0012]真皮層中的貼近人體組織的下層多孔支架材料為交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，是海綿通過(guò)物理方法、化學(xué)方法或兩者結(jié)合的方法進(jìn)行交聯(lián)后形成的。
[0013]表皮層若為膠原與殼聚糖的共混材料，其中膠原的含量為50~99wt% ;真皮層若為膠原與殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、海藻酸鹽或聚乙烯醇的共混材料，其中膠原的其中膠原的含量為30~99wt%。
[0014]同時(shí)本發(fā)明還提供了該人工皮膚的制備方法，制備方法包括以下步驟:
步驟1:以弱酸溶液為溶劑，配置濃度較高的膠原或膠原復(fù)合溶液，濃度為0.6~2wt%，裝入透析袋中透析2~7天，形成溶液I ;
步驟2:以弱酸溶液為溶劑，配置濃度較低的膠原或膠原復(fù)合溶液，濃度為0.2~lwt%，形成溶液II ;
步驟3:將溶液II注入一定深度的模具中，在_80~-20°C下冷凍干燥成海綿，作為真皮層的下層；
步驟4:將步驟3所得到的海綿，使用物理方法、化學(xué)方法或兩者結(jié)合的方法進(jìn)行交聯(lián)，得到交聯(lián)的海綿層；
步驟5:將溶液I注入一定深度的模具中，在0~80°C下通風(fēng)干燥成薄膜；
步驟6:在步驟5所得的薄膜上注入一定厚度的溶液I，流平一段時(shí)間后，將步驟4所得到的海綿層直接帖附在溶液I上，再在-80~-2(TC下冷凍干燥成型，從而形成帶有含梯度孔隙率結(jié)構(gòu)的真皮層和帶有微孔結(jié)構(gòu)的表皮層的人工皮膚。
[0015]其中，步驟I中，所述濃度較高的膠原或膠原復(fù)合溶液，濃度為0.6~2wt%,若為膠原復(fù)合溶液，其中材料為膠原蛋白和殼聚糖的共混材料，共混材料中膠原的含量為50~99wt% ;步驟2中，所述的濃度較低的膠原或膠原復(fù)合溶液，濃度為0.2~lwt%，若為膠原復(fù)合溶液，其中材料為膠原與殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、海藻酸鹽或聚乙烯醇的共混材料，共混材料中膠原的含量為30~99wt% ;步驟I和步驟2中，所述的弱酸為稀鹽酸、醋酸、甲酸、丙酸、丁酸或乳酸中的一種或多種；步驟I中所述的透析，透析介質(zhì)為弱酸溶液或水或兩者交替進(jìn)行。
[0016]其中，步驟4中，所述的交聯(lián)方法中，物理方法有紫外輻照、熱脫氫法、輻照滅菌法；化學(xué)交聯(lián)方法有使用碳化二亞胺、二胺、環(huán)氧化合物、羥基琥珀酰亞胺、二苯基磷酸鹽(DPPA)、戊二醛、甲醛、乙醛酸、京尼平進(jìn)行交聯(lián)，使用化學(xué)交聯(lián)劑后，需要經(jīng)過(guò)洗脫程序去除交聯(lián)劑的殘留。
[0017]一種人工皮膚，由上述的方法制備而得，其特征在于:表皮層和真皮層中，所使用的膠原蛋白，是從動(dòng)物的皮膚、跟腱等組織，通過(guò)酶解、鹽析、透析等步驟提取的去端肽膠原蛋白，可以是I型膠原蛋白，也可以是I型和III型膠原蛋白的混合物。
[0018]一種人工皮膚，由上述的方法制備而得，其特征在于:真皮層中，還可以加入抗生素、維生素、其他組織中提取的表皮細(xì)胞或自體組織提取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0019]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)有:
1.表皮層透析工藝制得，內(nèi)部分子具有取向性結(jié)構(gòu)，使得表皮層具有與人體皮膚類(lèi)似的有力學(xué)強(qiáng)度，手術(shù)中可以耐受縫合操作；
2.表皮層通過(guò)溶解揮發(fā)法制得，材料與人體表皮相同，具有微孔結(jié)構(gòu)，可使得人工皮膚具有與人體皮膚相似的透氧透濕性能，賦予人工皮膚呼吸功能，同時(shí)方面愈合過(guò)程中的消毒和給藥操作；
3.真皮層更加接近人體皮膚真皮層的結(jié)構(gòu)，為具有兩層不同孔隙率的三維多孔支架結(jié)構(gòu)組成，兩層因?yàn)榭紫堵什煌纬蓛蓚€(gè)層次的梯度結(jié)構(gòu)，利于不同類(lèi)型的細(xì)胞長(zhǎng)入和增殖，這種高度仿生的結(jié)構(gòu)更加有利于真皮再生；
4.真皮層的海綿結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)交聯(lián)，支架結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定、更富有韌性，有助于自體細(xì)胞的的增殖；
5.使用的膠原蛋白為無(wú)端肽膠原蛋白，去除了人工皮膚在應(yīng)用時(shí)的免疫排斥、異物反應(yīng)和