用于治療或預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病的組合物和方法
【專利說明】用于治療或預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病的組合物和方法
[0001]本申請是國際申請日2005年6月15日、國際申請?zhí)朠CT/US2005/021134于2007年I月17日進(jìn)入中國國家階段、申請?zhí)?00580024172.1、發(fā)明名稱“用于治療或預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病的組合物和方法”的申請的分案申請。
[0002]相關(guān)申請的交叉引用
[0003]本申請是2003年9月24日提交的在審美國申請10/671,299的部分繼續(xù)；其是2002年3月8日提交的美國申請10/093,686的繼續(xù)；其是2000年2月9日提交的美國申請09/500，500的繼續(xù)；其要求1999年8月23日提交的美國臨時申請60/150，259的優(yōu)先權(quán)，并且其是1998年5月22日提交的在審美國申請09/083，362的部分繼續(xù)，其要求1997年5月23日提交的美國臨時申請60/047，473的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004]本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防草酸鹽相關(guān)病癥的組合物和方法。尤其是，本發(fā)明涉及包含降解草酸鹽或還原草酸鹽的細(xì)菌和酶的組合物和方法。
【背景技術(shù)】
[0005]腎-尿路結(jié)石疾病(尿石病)是全世界范圍的主要健康問題。大多數(shù)與尿石病有關(guān)的結(jié)石由單獨的草酸鈣組成，或者由草酸鈣加上磷酸鈣組成。其它疾病狀態(tài)也被證實與過量的草酸鹽有關(guān)。包括慢性陰部疼痛(vulvodynia)，與晚期腎病有關(guān)的草酸過多癥，心臟傳導(dǎo)失調(diào)，克羅恩氏病及其它腸衣疾病。
[0006]草酸和/或其鹽，草酸鹽存在于多種食物中，因此是人和動物膳食的許多組分的成分。在食用了含有增加量的草酸的食物后可能發(fā)生草酸鹽吸收的增加。諸如菠菜和食用大黃的食物公知含有高含量的草酸鹽，但是大量其它食物和飲料也含有草酸鹽。因為草酸鹽存在于如此多樣的食物中，因此草酸鹽含量低并且同時還可口的膳食難以配制出來。此外，依從低草酸鹽膳食常常也是有疑問的。
[0007]內(nèi)源性草酸鹽也由正常組織酶代謝產(chǎn)生。包括可以吸收的膳食草酸鹽的草酸鹽以及代謝產(chǎn)生的草酸鹽不會被組織酶進(jìn)一步代謝并且因此必須被排出體外。這樣的排泄主要經(jīng)腎進(jìn)行。腎液中草酸鹽的濃度非常關(guān)鍵，草酸鹽濃度的增加會引起高危形成草酸鈣晶體，并隨后由此形成腎結(jié)石。
[0008]腎結(jié)石的高危形成圍繞著大量目前尚未完全明白的因素。腎或尿路結(jié)石疾病發(fā)生在西方國家多至12 %的人群中，并且約7 O %的結(jié)石由草酸鈣或草酸鈣加上磷酸鈣組成。一些個體(例如，患有諸如克羅恩氏病，炎癥性腸病或脂肪痢以及進(jìn)行過空腸回腸(jejunoileal)分流外科手術(shù)的病人)在其膳食中比其他來源吸收更多的草酸鹽。對于這些個體，草酸鹽尿石病的發(fā)病率明顯增加。發(fā)病率的提高是由于腎和尿液中草酸鹽水平的增加，并且人的這樣最普遍的高草酸尿綜合癥被稱為腸源性高草酸尿。草酸鹽也是晚期腎病病人的難題并且最近有證據(jù)(Solomons，C.C.，Μ.H.Melmed，S.M.Heitler
[1991] "Calciumcitrate for vulvar vestibulitis〃Journal of Reproductive Medicine 36: 879-882)尿草酸鹽的升高也與外陰前庭炎(慢性陰部疼痛)有關(guān)。
[0009]降解草酸鹽的細(xì)菌已經(jīng)分離自人的糞便(Allison M.J.，H.M.Cook，D.B.Milne,S.Gallagher, R.V.Clayman
[1986]^Oxalate degradat1n by gastrointestinalbacteria from humans"J.Nutr.116: 455-460)。這些細(xì)菌類似于草酸鹽-還原細(xì)菌，這些草酸鹽還原細(xì)菌分離自大量動物品種的腸渣(Dawson，K.A.，M.J.Allison,P.A.Hartman
[1980]〃I so Iat 1n and some characteristics of anaerobicoxalate-degrading bacteria the rumen〃Appl.Environ.Microb1l.40:833-839 ；Allison，M.J.，Η.M.Cook
[1981]"Oxalate degradat1n by microbes of the largebowel of herbivores: the effect of dietary oxalate〃Science 212: 675-676 ；Daniel，S.L.，P.A.Hartman，M.J.Allison
[1987]"Microbial degradat1n of oxalatein the gastrointestinal tracts of rats〃Appl.Environ.Microb1l.53:1793-1797)。這些細(xì)菌不同于以前描述的生物體并且已經(jīng)產(chǎn)生了一個新種和一個新屬命名(Allison，M.J.，K.A.Dawson, ff.R.Mayberry, J.G.Foss
[1985] ^Oxalabacter formigenes gen.nov.，sp.nov.； oxalate-degrading anaerobes that inhabit the gastrointestinaltract〃Arch.Microb1l.141:1-7)。
[0010]并不是所有人在他們的腸道中均攜帶0.formigenes菌群(Allison，M.J.，S.L.Daniel, N.A.Comick
[1995]"Oxalate-degrading bacteria〃In Khan, S.R.(編輯.)，Calcium Oxalate in B1logical Systems CRC Press ;Doane，L.T.，M.Liebman，D.R.Caldwell
[1989]"Microbial oxalate degradat1n: effects on oxalate andcalcium balance in humans^Nutrit1n Research 9:957-964)。在進(jìn)行過回腸空腸分流外科手術(shù)的人的糞便樣品中只具有低濃度的草酸鹽降解細(xì)菌或完全缺乏草酸鹽降解細(xì)菌(Allison 等
[1986] 〃0xalate degradat1n by gastrointestinal bacteria fromhumans〃J.Nutr.116: 455-460)。同時，某些人和動物可以維持0.formigenes的菌落，但是因為不能清楚明白的理由仍然具有過量水平的草酸鹽。
[0011]目前需要治療人和動物減少它們體內(nèi)的草酸鹽水平，由此治療或預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病的方法。合乎需要的方法包括施用還原草酸鹽的組合物。
[0012]發(fā)明概述
[0013]本發(fā)明包括治療和預(yù)防草酸鹽相關(guān)病癥的組合物和方法。本發(fā)明的組合物包含可以降低草酸鹽的微生物以及包含還原草酸鹽的酶的組合物。本發(fā)明的方法包含施用該組合物治療或預(yù)防草酸鹽-相關(guān)的病癥。一個實施方案包括通過降低腸道中草酸鹽的量降低發(fā)展草酸鹽-相關(guān)的失調(diào)的危險的方法。腸道中的這種降低導(dǎo)致系統(tǒng)草酸鹽水平的減少由此促進(jìn)身體健康。
[0014]在一個本發(fā)明的實施方案中，通過向腸道補(bǔ)充草酸鹽-降解細(xì)菌實現(xiàn)草酸鹽吸收的減少。在優(yōu)選的實施方案中，這些細(xì)菌是Oxalobacter formigenes.。這些細(xì)菌使用草酸鹽作為生長底物。這樣的利用降低了腸中可溶性草酸鹽的濃度，由此降低了用于吸收的草酸鹽的量。腸道中草酸鹽的降低還可以從循環(huán)系統(tǒng)除去草酸鹽。本發(fā)明的方法預(yù)計可以全面降低個體體內(nèi)草酸鹽的量。
[0015]在特定的實施方案中，本發(fā)明提供了向處在患草酸鹽-相關(guān)疾病高危中的人的腸道遞送0.formigenes的方法和組合物。這些細(xì)菌及其子代在腸中復(fù)制并從腸道除去草酸鹽，由此降低可用于吸收的草酸鹽的量并引起從血液向腸中排泄草酸鹽的提高。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，除了利用草酸鹽作為底物的0.formigenes,降解草酸鹽的微生物也可用于實現(xiàn)治療性的草酸鹽降解由此降低患尿石病及其它草酸鹽-相關(guān)疾病的危險。這樣的其它微生物可以是，例如，諸如梭狀芽孢桿菌或假單胞桿菌的細(xì)菌。另外，本發(fā)明包括用于給可用于將最初不能分解草酸鹽的天然微生物轉(zhuǎn)化成能夠還原草酸鹽的微生物的微生物提供賦予草酸鹽還原功能的外源多核苷酸的方法和組合物。
[0017]在本發(fā)明的一個實施方案中，組合物包含用于降解草酸鹽產(chǎn)生使這些微生物能夠降解草酸鹽的酶的微生物。在其他的實施方案中，該組合物可以包含用使轉(zhuǎn)化的微生物能夠降解草酸鹽的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的微生物。編碼草酸鹽-還原基因的多核苷酸序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。編碼草酸鹽還原微生物，諸如細(xì)菌或真菌中發(fā)現(xiàn)的酶或其它草酸鹽-還原酶的多核苷酸序列可用于本發(fā)明的方法中。多核苷酸可被用來轉(zhuǎn)化細(xì)胞使細(xì)胞具有比天然存在的草酸鹽還原微生物更高的草酸鹽-還原活性，相同的草酸鹽-還原活性，或者更低的草酸鹽-還原活性。多核苷酸也可用于合成的或者離體系統(tǒng)來提供具有草酸鹽還原活性的蛋白。
[0018]甲酰基-CoA轉(zhuǎn)移酶和草酰-CoA脫羧酶已經(jīng)被確定為在草酸鹽降解中起作用。用于本發(fā)明的方法和組合物中的酶包括但不限于甲?；?CoA轉(zhuǎn)移酶，草酰-CoA脫羧酶，草酸鹽氧化酶，草酸鹽脫羧酶及其它酶，輔因子，以及輔酶，取代草酸鹽降解途徑或者參與草酸鹽代謝途徑，尤其是草酸鹽還原。
[0019]在本發(fā)明的一個實施方案中，合適的宿主可以用編碼這些酶或者相關(guān)活性的酶由此使轉(zhuǎn)化的宿主能夠增加草酸鹽降解的外源多核苷酸轉(zhuǎn)化。宿主可以是，例如，尤其最適宜于口服和/或定殖于腸的微生物?；蛘?，宿主可以是一旦轉(zhuǎn)化將產(chǎn)生所需的酶活性，由此當(dāng)消耗該植物材料時使這些活性可以被腸利用的植物。或者，轉(zhuǎn)化的植物可以具有較低量的草酸鹽，任選地由于由轉(zhuǎn)化提供的蛋白的作用，由此當(dāng)消耗時，植物將不向膳食提供與未轉(zhuǎn)化的植物一樣多的草酸鹽。
[0020]本發(fā)明也包括用于用草酸鹽降解或者草酸鹽-還原酶轉(zhuǎn)化的植物的方法和組合物，其中這些植物具有對真菌提高的抗性，所述真菌需要草酸鹽用于使植物致病或者產(chǎn)生草酸使植物致病。
[0021]本發(fā)明還包括含有用于降低草酸鹽水平以便治療或者預(yù)防草酸鹽相關(guān)病癥的酶的方法和組合物。例如，通過施用起降解草酸鹽作用的酶實現(xiàn)。這些酶可以是分離和純化的或者可以作為細(xì)胞裂解物施用。細(xì)胞裂解物可以由具有草酸鹽-還原功能的微生物，例如0.formigenes制成。在特定的實施方案中，施用的酶是本發(fā)明的一種或多種酶，諸如但不限于草酸鹽脫羧酶，草酸鹽氧化酶，甲?；?CoA轉(zhuǎn)移酶和草酰-CoA脫羧酶。任選地，可以施用改進(jìn)酶活性的其他因子。這些其他因子可以是例如，草酰CoA，MgCljP TPP(硫胺素二磷酸，維生素B1的活性形式)。包括酶的組合物包含一或多種酶，和任選地，輔因子，輔酶及其它分別或者組合加強(qiáng)酶活性的因子。
[0022]在本發(fā)明的一個實施方案中，通過施用由重組微生物諸如大腸桿菌產(chǎn)生的草酸鹽-降解酶實現(xiàn)草酸鹽水平的降低，所述大腸桿菌已經(jīng)被轉(zhuǎn)化表達(dá)草酸鹽-降解酶。重組宿主可以活的或者非-活的形成施用。本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及用于口服的藥物組合物和/或營養(yǎng)增補(bǔ)劑。這些組合物釋放草酸鹽降解微生物或者草酸鹽降解酶到人或者動物的腸內(nèi)。本發(fā)明的組合物包含藥用的制劑。例如，本發(fā)明的方法和組合物包含向預(yù)定位置提供組合物，諸如向受體的腸遞送組合物的劑量輸送系統(tǒng)。本發(fā)明的組合物可以作為食物諸如，牛奶，肉和酸奶的成分施用。
[0023]在本發(fā)明進(jìn)一步的實施方案中，在缺乏草酸鹽-降解細(xì)菌的馴養(yǎng)，農(nóng)業(yè)或者外來動物中通過分別或者組和施用草酸鹽-降解微生物，植物和酶實現(xiàn)草酸鹽吸收的下降。
[0024]