一種豬用三聯(lián)滅活疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬用三聯(lián)滅活疫苗的制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌是當(dāng)今危害養(yǎng)豬業(yè)的重要 細(xì)菌性病原，常與豬圓環(huán)病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬瘟病毒或豬流感病毒發(fā)生 混合感染，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。
[0003] 副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPs)是豬Glasser' s病的病原體，隸屬 于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，是豬上呼吸道的一種共棲菌，侵入機(jī)體會(huì)引起以纖維素性多發(fā) 性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征的全身性疾病。HPs只感染豬，具很強(qiáng)的宿主特異性， 成年豬不表現(xiàn)明顯癥狀，多發(fā)于各年齡段的仔豬和架子豬，在斷奶前后和保育舍階段發(fā)病， 通常見(jiàn)于5~8周齡，發(fā)病率達(dá)40%，死亡率可達(dá)50%。HPs血清型眾多，目前已鑒定了 15 個(gè)血清型，但不能分型的副豬嗜血桿菌仍有很多，占分離株的15. 2%~41 %。HPs產(chǎn)生耐藥 性較快，耐藥后敏感性不易恢復(fù)，近年，副豬嗜血桿菌病普遍發(fā)生，多種抗菌藥物的使用導(dǎo) 致耐藥性極為普遍，因此，制定合理免疫防疫制度，開(kāi)發(fā)安全有效的疫苗尤為重要。
[0004] 豬鏈球菌（Streptococcus suis, S. suis)是豬的重要病原菌之一，臨床上常引起 急性型敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎及淋巴結(jié)膿腫，可侵害各年齡段豬，病豬及帶菌豬 是主要傳染源，本病發(fā)生無(wú)季節(jié)性，多成地方流行性。鏈球菌抗原構(gòu)造復(fù)雜，有核蛋白抗原 (P抗原），無(wú)群特異性，及群特異抗原（C抗原）和型特異抗原。根據(jù)莢膜多糖抗原（CPS)可 將鏈球菌分為35個(gè)血清型，即1型~34型和1/2型（同時(shí)含有1型和2型抗原的菌株）， 根據(jù)C抗原不同，可將鏈球菌分成A、B、C、D、E、F、G等20個(gè)血清群。近年，豬鏈球菌病在我 國(guó)流行呈上升趨勢(shì)，并與多種細(xì)菌性疾病呈混合感染，導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。
[0005] 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)是豬傳染 性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropnmonia，PCP)的病原菌，PCP是主要以肺出血、壞 死和纖維素性滲出為主要病變的高度接觸性傳染病。該病可感染各年齡段豬只，并引起急 性和慢性感染，發(fā)病率和死亡率20 %以上，急性型死亡率可高達(dá)80 % -100 %。APP血清型較 多，目前分離鑒定出了 15種血清型，根據(jù)APP生長(zhǎng)是否需要NAD因子，可分為兩個(gè)生物型， 依賴外援NAD因子生長(zhǎng)的是生物I型，不依賴NAD因子生長(zhǎng)的是生物II型。溶血毒素是APP 分泌到菌體細(xì)胞外的一個(gè)主要的毒力因子，被稱為溶血毒素和細(xì)胞毒素，歸入RTX(Itepeats in the structural toxin)毒素家族，因此 APP 的 RTX 毒素稱為 Apx(Actinobacillur pleuropneumoniae-RTX-toxin)毒素，包括 Apx I、Apx II、Apx III、Apx IV。所有血清型 均能分泌Apx IV，只在體內(nèi)表達(dá)，體外檢測(cè)不到，大多數(shù)血清型只產(chǎn)生Apx I、Apx II、Apx III的兩種，少數(shù)血清型只產(chǎn)生一種。目前，對(duì)該病的預(yù)防主要以致病血清型的全菌體滅活苗 為主，雖然PCP弱毒疫苗及ghost疫苗較滅活疫苗的免疫保護(hù)效果有一定程度的提高，但是 弱毒疫苗免疫原性較低，存在毒力返強(qiáng)的可能性，ghost疫苗存在菌體裂解不徹底等缺點(diǎn)。 如果開(kāi)發(fā)亞單位疫苗則需要摸索適宜的抗原，進(jìn)一步涉及菌種血清型的選擇、抗原的提取 等諸多環(huán)節(jié)，還要考慮免疫效果和不良反應(yīng)等技術(shù)問(wèn)題。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)中，市場(chǎng)上的疫苗只有預(yù)防副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病、豬傳染性胸膜 肺炎的單苗或二聯(lián)苗，而這三種病通常呈混合感染或繼發(fā)感染，使用單苗或二聯(lián)苗需要多 次免疫，對(duì)豬應(yīng)激較大，成本高。在開(kāi)發(fā)聯(lián)苗的技術(shù)實(shí)踐中，首先應(yīng)當(dāng)確?？乖瓕?duì)各單一致 病菌的免疫作用，那么菌種血清型的選擇尤為重要，同時(shí)，應(yīng)當(dāng)保證聯(lián)苗整體對(duì)三種致病菌 均具有有效的免疫效果，且不會(huì)發(fā)生不良反應(yīng)，此外，由于同時(shí)涉及不同類別的抗原，那么 抗原的提取、滅活以及疫苗的制備等方面均需要突出的創(chuàng)造性勞動(dòng)才可能實(shí)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種豬用三聯(lián)滅活疫苗的制備方法， 以解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種同時(shí)免疫副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌以及豬傳染性胸膜肺炎放線 桿菌的疫苗制備方法的技術(shù)問(wèn)題。
[0008] 本發(fā)明解決的另一技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)對(duì)抗原的創(chuàng)新性選擇，以提升疫苗對(duì)上述三種 致病菌的免疫效果。
[0009] 本發(fā)明解決的再一技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)對(duì)抗原的創(chuàng)新性選擇，以避免疫苗發(fā)生不良反 應(yīng)。
[0010] 本發(fā)明解決的又一技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)對(duì)工藝的創(chuàng)新設(shè)計(jì)，以提升上述方法的制備效 率。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0012] -種豬用三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，該方法是以副豬嗜血桿菌4型菌體、副豬嗜 血桿菌5型菌體、豬鏈球菌2型菌體、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素 Apx I、豬傳染 性胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素 Apx II、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌細(xì)胞毒素 Apx III為抗 原，經(jīng)滅活后制備的。
[0013] 優(yōu)選的，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素 Apx I是由豬傳染性胸膜肺炎 放線桿菌3型提取的，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素 Apx II是由豬傳染性胸膜肺炎 放線桿菌7型提取的，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌細(xì)胞毒素 Apx III是由豬傳染性胸膜肺炎 放線桿菌10型提取得到的。
[0014] 進(jìn)一步優(yōu)選的，該方法包括以下步驟：
[0015] 1)分別取豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌3型培養(yǎng)液、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌7 型培養(yǎng)液、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌10型培養(yǎng)液，分別固液分離收集上清；
[0016] 2)將步驟1)所述上清分別通過(guò)超濾管濃縮，分別加入飽和硫酸銨取沉淀，分別滅 活，分別濃縮，再分別調(diào)整毒素濃度至200-400ug/mL，由此分別得到Apx I抗原溶液、Apx II抗原溶液和Apx III抗原溶液；
[0017] 3)分別取副豬嗜血桿菌4型培養(yǎng)液，副豬嗜血桿菌5型培養(yǎng)液、豬鏈球菌2型培養(yǎng) 液，分別滅活，分別濃縮，再分別調(diào)整菌體濃度至IO 7~10 12CFU/mL，由此分別得到副豬嗜血 桿菌4型抗原溶液，副豬嗜血桿菌5型抗原溶液、豬鏈球菌2型抗原溶液；
[0018] 4)取步驟2)所述Apx I抗原溶液、Apx II抗原溶液、Apx III抗原溶液，取步驟3) 所述副豬嗜血桿菌4型抗原溶液，副豬嗜血桿菌5型抗原溶液、豬鏈球菌2型抗原溶液，六 者以（1~2) : (1~2) : (1~2) : (1~2) : (1~2) : (1~2) (v/v)的比例均勻混合得到混 合抗原溶液；
[0019] 5)以步驟4)所述混合抗原溶液為抗原制備疫苗。
[0020] 優(yōu)選的，步驟1)所述的培養(yǎng)液是通過(guò)以下方法得到的：取菌種接種于TSA/NAD平 板培養(yǎng)基中，35~38°C培養(yǎng)18~24小時(shí)，挑取單菌落接種于TSB/NAD液體培養(yǎng)基中，35~ 38°C培養(yǎng)12~16小時(shí)，為一級(jí)種子；取所述一級(jí)種子以0. 5~2% (v/v)的比例接種至 TSA/NAD培養(yǎng)基中，35~38°C培養(yǎng)12~16小時(shí)，得到二級(jí)種子；再取所述二級(jí)種子進(jìn)行培 養(yǎng)，即得到所述培養(yǎng)液。
[0021] 優(yōu)選的，步驟2)中對(duì)所述上清液先以300KD孔徑的超濾管濃縮，而后加入飽和硫 酸銨取沉淀，將沉淀重新溶解后再以3KD孔徑的超濾管濃縮，而后再進(jìn)行滅活，在此基礎(chǔ)上 進(jìn)一步優(yōu)選的，加入飽和硫酸銨后溶液中硫酸銨濃度為55~60% (w/w)。
[0022] 優(yōu)選的，步驟2)或步驟3)所述滅活是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的：按溶液體積的 0. 25~0. 35%加入甲醛溶液，35~38°C滅活24~48小時(shí)，期間每隔2~3小時(shí)攪拌一次， 每次攪拌持續(xù)3~5分鐘；更優(yōu)的，滅活36小時(shí)。
[0023] 優(yōu)選的，步驟2)所述濃縮是以3KD孔徑的超濾管實(shí)現(xiàn)的。
[0024] 優(yōu)選的，步驟3)所述濃縮是以0.45μπι孔徑的濾膜實(shí)現(xiàn)的。
[0025] 優(yōu)選的，步驟5)取頂S 1313VG疫苗佐劑與水以（2. 5~3. 5) : 7體積比混合，加入 維生素 Ε，調(diào)整佐劑濃度至9~Ilmg/mL，再過(guò)濾除菌，得到稀釋液，利用所述稀釋液用于抗 原稀釋。
[0026] 在以上技術(shù)方案中，所述"經(jīng)滅活后制備"中的"制備"是指利用所述抗原以疫苗技 術(shù)領(lǐng)域的公知制備方