0 0C )中保存。
[0025]優(yōu)選地，加入按組織懸液重量計0.4%的甲醛，在20-50°C下滅活24_96小時，更優(yōu)選在37°C滅活24小時并且在滅活時每隔2-4小時攪拌一次。
[0026]優(yōu)選地，蜂膠乙醇浸出液，優(yōu)選的蜂膠在低溫下貯存，使用時先將蜂膠置-15°C冷凍24-48小時，再用冷凍粉碎機磨碎過篩，按1:4(W/V)的比例加入95%乙醇，在37°C浸提48-72小時，冷卻、過濾，即得純凈蜂膠乙醇浸出液(透明栗色溶液)，浸出液的蜂膠含量須大于50%。
[0027]有益效果:本發(fā)明方法獲得的滅活疫苗副作用小，免疫效果可達90%以上，遠高于目前國內現(xiàn)行標準75%，且具有安全性好、保存長期及綠色環(huán)保等優(yōu)點。
【具體實施方式】
:
[0028]實施例1
[0029]兔病毒出血癥CVCC AV272毒株的傳代培養(yǎng)
[0030]將保藏后的兔病毒性出血癥病毒CVCC AV272菌株用生理鹽水作10倍稀釋，接種于50-55日齡的健康易感且抗體陰性家兔。每只皮下注射lmL，在該家兔中的病毒滴度可保持在HA彡1:1024以上。無菌采集接種后12-72小時內死亡的兔種，無菌采集死亡時間不超過I小時的家兔且具有典型病理變化的肝臟組織，并剔除其上的結締組織作為毒種。
[0031]采用傳4?10代的毒株CVCC AV272菌株接種，將剔除結締組織的死亡兔的肝臟加生理鹽水搗碎、研磨過濾配制，肝臟病理組織與滅菌生理鹽水的比例為1:9 (W/V) ο加入青鏈霉素各1000IU/mL，3000r/min離心20min，吸取上清液，分裝入無菌小玻璃瓶，低溫冰箱(-20 0C )中保存。
[0032]實施例2:
[0033]兔病毒出血癥組織懸液制備
[0034]將保藏后的兔病毒性出血癥病毒CVCC AV272菌株用生理鹽水作10倍稀釋，接種于50-55日齡的健康易感且抗體陰性家兔。每只皮下注射lmL，在該家兔中的病毒滴度可保持在HA彡1:1024以上。無菌采集接種后12-72小時內死亡的兔種，無菌采集死亡時間不超過I小時的家兔且具有典型病理變化的肝臟組織，并剔除其上的結締組織作為毒種。
[0035]采用傳4?10代的毒株CVCC AV272菌株接種，將剔除結締組織的死亡兔的肝臟加生理鹽水搗碎、研磨過濾配制，肝臟病理組織與滅菌生理鹽水的比例為1:9(W/V)。按照組織懸液總量的0.4%加入甲醛溶液進行滅活，滅活條件為:在37°C下滅活24小時，并每隔2-4小時攪拌一次，滅活后加入優(yōu)質蜂膠乙醇浸出液，混合乳化。滅活結束后進行無菌檢驗、滅活檢驗及血凝價檢驗。
[0036]實施例3:
[0037]按每毫升疫苗中含兔病毒性出血癥病理組織多0.05g，蜂膠干物質含量為8?15mg，黃芪多糖l_3mg，根據(jù)預配苗的總量(50萬mL)、兔病毒性出血癥病理組織量(0.1g/ml)以及蜂膠乙醇浸出液的濃度(32g/mL)，按比例添加所需兔病毒性出血癥病理組織懸液(25萬mL)、蜂膠乙醇浸出液(125mL)及注射用水的量將所需量的注射用水(25萬mL)注入配苗乳化罐中，后加入所需量的兔病毒性出血癥病理組織懸液在轉速為2000rpm/min條件下攪拌5-10min，然后在攪拌狀態(tài)下緩慢加入蜂膠乙醇浸出液和黃芪多糖，繼續(xù)攪拌15-20分鐘，使其充分混合乳化，分裝。
[0038]盡管上述對本發(fā)明做了詳細說明，但不限于此，本技術領域的技術人員可以根據(jù)本發(fā)明的原理進行修改，因此，凡按照本發(fā)明的原理進行的各種修改都應當理解為落入本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1.一種兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗，包括抗原和佐劑，其特征在于，所述抗原為兔病毒性出血癥CVCC AV272菌株，所述佐劑為蜂膠乙醇浸出液，配苗時每毫升疫苗中蜂膠干物質含量為8-15mg，還包括l-3mg的黃芪多糖。2.如上述權利要求1所述的兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗，其特征在于，所述疫苗中不含有硫柳萊。3.如上述權利要求1所述的兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗，其特征在于，所述蜂膠乙醇浸出液的制備方法為:先將蜂膠置于_15°C條件下冷凍24?48小時，再用冷凍粉碎機磨碎過篩，按1:4(W/V)的比例加入95%乙醇，在37°C浸提48?72小時，冷卻、過濾，得純凈的透明栗色的蜂膠乙醇浸出液，浸出液中蜂膠含量大于50%。4.一種如權利要求1?3任一項所述的兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗的制備方法，其特征在于，用病兔肝組織制成乳劑，接種易感兔，分離和篩選出毒株CVCC AV272菌株，該方法包括以下步驟: (1)用含毒的肝臟組織懸液通過易感兔連續(xù)傳代培育，篩選出強毒毒株CVCCAV272菌株; (2)以CVCCAV272菌株作為種毒，接種易感兔，采集接種后12?72小時以內發(fā)病死亡兔的肝臟，并剔除肝臟的結締組織； (3)將剔除結締組織的肝臟搗碎、研磨、過濾后配成組織懸液，并對該組織懸液進行滅活，滅活后組織懸液HA彡1:256，用于配苗； (4)將步驟(3)得到的滅活乳劑與佐劑進行混合，滅菌后分裝。5.如權利要求4所述的兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗的制備方法，其特征在于，制造疫苗時，將接種易感兔病料在無菌器皿中研磨，邊研磨邊按質量比10%加入無菌生理鹽水制備成勻漿，用5號篩過濾；凍融3次后，加入青鏈霉素各1000IU/mL，6000r/min離心40min，吸取上清液，分裝入無菌小玻璃瓶，低溫冰箱(_20°C)中保存。6.如權利要求4所述的兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)為:將兔病毒性出血癥毒株CVCC AV272菌株用生理鹽水作10倍稀釋，接種50?55日齡山東各地區(qū)養(yǎng)殖場易感兔，每只頸部皮下注射lmL，無菌采集接種后易感兔，采集接種后12?72小時以內死亡時間在I小時內的病死兔具有典型病理變化的肝臟組織。7.如權利要求4所述的兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗的制備方法，其特征在于，步驟(3)中加入按乳劑重量計0.1%?0.6%的甲醛，在37°C下滅活24?96小時，且在滅活時每隔2?4小時攪拌一次。8.如權利要求4所述的兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗的制備方法，其特征在于，其中步驟⑷滅活乳劑與佐劑按比例進行無菌乳化，所述佐劑包括優(yōu)質蜂膠乙醇浸出液，還包括黃芪多糖。9.根據(jù)權利要求4所述的兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗的制備方法，其特征在于，步驟(4)得到的兔病毒性出血癥滅活疫苗中每_升含有0.05g兔病毒性出血癥肝臟病理組織，優(yōu)質蜂膠8?15mg，還包括I?3mg黃苗多糖。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種適用于兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗的制備方法，該方法包括以下步驟：首先將兔病毒性出血癥病毒CVCC？AV272菌株接種于家兔，無菌采集24—96小時內死亡家兔的肝臟，并剔除其上的結締組織；再將其搗碎、研磨過濾后配成乳劑，對該乳劑進行滅活，并配置以優(yōu)質蜂膠和黃芪多糖與之進行混合，得到上述滅活疫苗。本發(fā)明方法獲得的滅活疫苗副作用小，免疫效果可達90％以上，遠高于目前國內現(xiàn)行標準75％，且具有安全性好、保存長期及綠色環(huán)保等優(yōu)點。
【IPC分類】A61K39/39, A61P31/14, A61K39/12
【公開號】CN104998258
【申請?zhí)枴緾N201510478394
【發(fā)明人】王曉麗, 王永明, 李士成, 朱萬光, 李曉霞, 任明明, 孟薇薇, 趙飛飛
【申請人】山東華宏生物工程有限公司
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年8月6日