一種鴨病毒性肝炎組織滅活苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鴨病毒性肝炎組織滅活苗及其制備方法。 二、
【背景技術】
[0002] 鴨病毒性肝炎簡稱鴨肝炎，是由鴨病毒性肝炎病毒引起鴨的一種增強型以肝臟呈 現(xiàn)出血性炎癥為特征的急性烈性傳染病。1945年在美國首次發(fā)現(xiàn)本病，并命名為I型鴨病 毒性肝炎，1965年在英國發(fā)現(xiàn)了鴨病毒性肝炎II型，1969年在美國發(fā)現(xiàn)了鴨病毒性肝炎 III型。目前，I型呈世界性分布，并曾報道在印度、埃及和美國發(fā)現(xiàn)I型鴨肝炎病毒的變異 株。II型和III型鴨病毒性肝炎分別局限于英國和美國。在國內，鴨病毒性肝炎20世紀 80年代初期起本病在我國大面積流行，疫情能夠被鴨病毒性肝炎I型弱毒疫苗的免疫所控 制，但是雛鴨往往在疫苗奏效前即發(fā)病死亡。鴨肝炎I型可引起雛鴨的嚴重死亡，死亡率高 達90%，中成鴨一般不發(fā)病。病鴨的特征是意識紊亂，頻頻抽搐，肝臟呈斑點狀出血，膽囊腫 大，膽汁顏色變淡。本專利所述鴨肝炎主要指鴨肝炎I型引起鴨肝炎。
[0003] 目前對鴨肝炎的最佳預防方案是利用鴨肝炎組織滅活苗免疫母鴨，或在利用鴨肝 炎組織滅活苗免疫產(chǎn)蛋鴨或產(chǎn)蛋雞后制備高免卵黃抗體，在鴨出殼后1日齡或7日齡皮下 注射1頭份/只高效價抗鴨肝炎病毒卵黃抗體。但是由于鴨肝炎病料中抗原含量較低，市 售卵黃抗體往往效價不高，預防效果較差，急需開發(fā)生產(chǎn)性能更好組織滅活苗免疫母鴨或 蛋鴨。雖然也有商業(yè)生產(chǎn)單位用從實驗室培養(yǎng)的鴨肝炎病毒制備的抗原，但是需很多的設 備和高層次人員生產(chǎn)，過程也比本專利所述方法復雜。 三、

【發(fā)明內容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種鴨病毒性肝炎組織滅活苗及其制備方法。 這種抗原誘導的鴨卵黃抗體效價高于現(xiàn)有常規(guī)方法，簡單易行，經(jīng)濟價值高。
[0005] 本發(fā)明直接使用患鴨肝炎病死的鴨肝臟，加入免疫佐劑制備鴨肝炎病毒抗原，簡 單易行。
[0006] 本發(fā)明所使用的黃芪是一種增強型中草藥，具有補氣的作用；當歸是一種增強型 中草藥，具有補血的作用；蜂膠含有多種免疫增強的成分，如黃酮等。
[0007] -種鴨病毒性肝炎組織滅活苗，通過以下制備方法得到：
[0008] 1.稱取等量當歸和黃芪混勻，再向當歸和黃芪中加入與當歸和黃芪總量相等的蒸 餾水（當歸：黃芪：蒸餾水=1: 1:2 (W/W/V)，文火煮沸30min提取有效成分，過濾提取液，并 除菌；用滅菌生理鹽水稀釋提取液至與所述蒸餾水等量，得到黃芪當歸提取液。
[0009] 2.將市售蜂膠-20°C冷凍后粉碎，過20目篩，向粉碎后的蜂膠中加入蜂膠重量3-4 倍的無水乙醇（W/V)，震蕩溶解10-12小時；自然沉淀后，取上清液得到蜂膠酊。
[0010] 3.按照1:3的比例（W/V)將鴨肝病料加入含有0. 5% (V/V)甲醛溶液的生理鹽水 中混合，用組織搗碎機搗碎鴨肝病料，過40目濾網(wǎng)得到鴨肝病料過濾液；分別向鴨肝病料 過濾液中加入鴨肝病料過濾液體積比1-5%的黃芪當歸提取液和1-2%的蜂膠酊（邊搖拌 邊加），37°C滅活10-12小時，得到鴨病毒性肝炎組織滅活苗。
[0011] 使用方法：
[0012] 1.免疫種鴨：每只產(chǎn)蛋種鴨頸部皮下注射2mL按照本發(fā)明制備的鴨病毒性肝炎組 織滅活苗，三周后種蛋中即含有抗鴨肝炎病毒的母源抗體。
[0013] 2.制備高免卵黃抗體：每只產(chǎn)蛋鴨鴨頸部皮下注射2mL鴨病毒性肝炎組織滅活 苗，重復2次，每次間隔2周。最后一次注射后三周，開始收集鴨蛋得到高免卵黃抗體。 四、【具體實施方式】：
[0014] 鴨肝炎病料可以收集臨床典型鴨肝炎病例的死鴨肝臟；或人工感染非免疫雛鴨， 發(fā)病死亡后收集病鴨肝臟。
[0015] 1.收集病死鴨肝臟1kg，凍存于-20°c冰柜，備用；
[0016] 2.黃芪當歸提取液的制備：
[0017] 稱取100g當歸飲片、100g黃芪飲片，加200ml蒸餾水，置IL燒杯中，文火煮沸 30min提取。利用紗布過濾提取液，再用除菌濾器濾過除菌。用滅菌生理鹽水將濾出液稀釋 至200ml，待用。
[0018] 3.蜂膠酊的制備：稱取市售蜂膠100g置-20°C冰柜冷凍。取出后將蜂膠粉碎，過 20目篩網(wǎng)，裝入磨口瓶中，加入400ml無水乙醇，過夜溶解。自然沉淀后，上清部分即為蜂膠 酊。
[0019] 4.抗原的制備：稱取100g鴨肝病料，與含0. 5% (V/V)甲醛溶液的300ml生理鹽 水混合，用組織搗碎機搗碎病料，用40目紗網(wǎng)過濾，將濾出液加入IL燒杯中，置磁力攪拌器 上，緩慢加入IOml黃芪當歸提取液和5ml蜂膠酊，灌裝入滅菌生理鹽水瓶中，置37°C溫箱 12小時，制備成為鴨病毒性肝炎組織滅活苗。
[0020] 5.免疫雞群：將上述增強型鴨病毒性肝炎注射，頸部皮下注射100只高產(chǎn)蛋雞，每 只lml，每半個月注射一次，共注射三次，最后一次注射后3周開始收集雞蛋，收集100個高 免雞蛋待用。
[0021] 6.高免卵黃抗體制備：
[0022] 6. 1.消毒雞蛋：將100個高免雞蛋用自來水清洗后，用濃度為1-2%的次氯酸鈉消 毒液浸泡3分鐘，璃干；
[0023] 6. 2.分離卵黃：在無菌室打開蛋殼，倒出蛋清，取出卵黃；
[0024] 6. 3.稀釋：在無菌室中，加入卵黃體積3倍的生理鹽水（生理鹽水中含0. 4% (V/ V)的甲醛溶液）；
[0025] 6.4.攪拌過濾：在無菌條件下將卵黃稀釋液攪拌成懸濁液，然后經(jīng)40目濾網(wǎng)過 濾；
[0026] 6. 5.分裝保存：在無菌條件下將濾液分裝于經(jīng)消毒的玻璃瓶或一次性塑料瓶中， 蓋上膠塞，保存溫度為4-8°C，得到高免卵黃抗體。
[0027] 7.實施效果：
[0028] 7. 1不同疫苗制備的卵黃抗體效果比較，見表1
[0029] 表1不同疫苗制備的鴨肝抗體效價測定結果
[0030]
[0031] 由表1可以看出，按照本發(fā)明所述方法制備的鴨病毒性肝炎組織滅活苗免疫產(chǎn)蛋 母雞制成的卵黃抗體效價明顯高于常規(guī)組織滅活苗制備的卵黃抗體（常規(guī)組織滅活苗制 備的卵黃抗體參考本實施例步驟4)制備，但是不加黃芪當歸提取液及蜂膠酊）誘導的抗體 滴度。
[0032] 7. 2臨床使用效果
[0033] 利用本發(fā)明制備的卵黃抗體免疫2000只患有鴨肝炎的雛鴨，免疫效果見表2。同 時使用市售鴨肝炎抗體免疫2000只患有鴨肝炎的雛鴨作為對照，結果免疫注射本發(fā)明制 備的卵黃抗體的患有鴨肝炎的雛鴨成活率達到95. 2%。
[0034] 表2不同來源鴨肝抗體免疫效果
[0035]
[0036] 由表2可以看出，注射按照本發(fā)明所述方法制備的卵黃抗體的患有鴨肝炎病鴨的 成活率明顯高于市售的鴨肝炎抗體。
【主權項】
1. 一種鴨病毒性肝炎組織滅活苗，其特征在于通過以下制備方法得到： 1) 稱取等量當歸和黃芪混勻，再向當歸和黃芪中加入與當歸和黃芪總量相等的蒸餾 水；所述當歸：黃芪：蒸餾水W/W/V = 1:1:2,文火煮沸30min提取有效成分，過濾提取液并 除菌；用滅菌生理鹽水稀釋提取液至與所述蒸餾水等量，得到黃芪當歸提取液； 2) 將市售蜂膠_20°C冷凍后粉碎，過20目篩，向粉碎后的蜂膠中加入蜂膠重量3-4倍 的無水乙醇，震蕩溶解10-12小時；自然沉淀后，取上清液得到蜂膠酊； 3) 按照1:3的比例W/V將鴨肝病料加入含有0. 5%甲醛溶液的生理鹽水中混合并搗碎 鴨肝病料，過40目濾網(wǎng)得到鴨肝病料過濾液；分別向鴨肝病料過濾液中加入鴨肝病料過濾 液體積比1-5%的黃芪當歸提取液和1-2%的蜂膠酊，37°C滅活10-12小時，得到鴨病毒性 肝炎組織滅活苗。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鴨病毒性肝炎組織滅活苗及其制備方法，是收集臨床自然發(fā)病的鴨病毒性肝炎病例或人工感染非免疫鴨發(fā)病后的肝臟，乳化后加入黃芪、當歸提取液、蜂膠酊等免疫增強劑，制備成為增強型鴨病毒性肝炎抗原，免疫產(chǎn)蛋種鴨后可生產(chǎn)抗鴨病毒性肝炎卵黃抗體。
【IPC分類】A61P31/12, A61K39/29, A61P1/16
【公開號】CN104998259
【申請?zhí)枴緾N201510358763
【發(fā)明人】常維山, 付石軍, 宋道禎
【申請人】山東農業(yè)大學
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年6月25日