用于大量出血的凍干纖維蛋白封閉劑的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請
[0002] 本申請是2009年6月18日提交的美國專利申請第12/487, 057號（授權）的部 分繼續(xù)申請案，美國專利申請第12/487, 057號已經在2012年11月6日收到授權的通知并 且在2013年2月6日之前支付授權費用。其中闡述的所有說明書、附圖和教導都明確地結 合于此作為參考，并且我們要求其中明確地作出的教導的優(yōu)先權。
技術領域
[0003] 本發(fā)明涉及一種方法，以產生的由來自酸溶液中的濃縮desAB纖維蛋白單體或 纖維蛋白II單體的無菌生物相容的凍干desAB纖維蛋白聚合物或纖維蛋白II聚合物組合 物以及凍干凝血酶組成的雙組分或雙層系統(tǒng)，從而用于作為粘合封閉劑組分和止血劑的應 用。標有制備（本發(fā)明）商標的ClotBlock呈現為各種實體形狀和厚度，ClotBlock可以 在使用和不使用按壓的情況下用于止血或在體內封閉組織。它尤其涉及到在沒有可生物降 解的支撐件或在應用于出血傷口上之后可分離的支撐件的情況下需要粘貼纖維蛋白凝塊， 以封閉組織和控制血管出血、表皮出血，骨出血或內部出血。本發(fā)明可以包括由透明質酸或 其它可生物降解的聚合物制成的可生物降解的支撐件。
【背景技術】
[0004] 器官切除、創(chuàng)傷或大面積皮膚創(chuàng)傷的嚴重出血有時難以控制。近來，基于纖維蛋白 的貼片已經經過測試，以使用纖維素或明膠支撐件封閉IV/V級創(chuàng)傷。然而，這些技術不能 應用于某些類型的步驟，諸如介入放射學、整形外科或腹腔鏡手術。此外，這些產品所使用 的"支撐件"在生物降解之前留在體內，造成對異物的嚴重的炎癥反應。
[0005] 當前的解決方案和限制。通常地，合成粘合劑用于血管或肺血管的緊密封閉以及 用于"粘合"皮膚切口的邊緣。通常在傷口形成瘢痕之后，通過生物降解、吸收或通過以結 痂的形式簡單脫離而消除這些膠。已經開發(fā)各種技術用于組織粘合劑的制備。其中一些是 合成來源的，諸如基于氰基丙烯酸酯（2-丁基氰基丙烯酸酯，2-辛基氰基丙烯酸酯）的膠、 或合成的聚合物以及含有生物材料（諸如另外具有止血特性的膠原蛋白或纖維蛋白）的其 他組織粘合劑。
[0006] 由于它們的止血和粘合性能，封閉劑，和特別是纖維蛋白封閉劑在過去的二十年 間已經廣泛用于大多數外科專業(yè)，以由于當它們聚合（1，2, 3)時粘附到人體組織的能力而 減少失血和術后出血。這些化合物用于封閉或加固已經被縫合或釘合的傷口的封閉；它們 也可以與在損傷區(qū)域上方按壓一起使用。纖維蛋白封閉劑是模擬凝血級聯的最后步驟的生 物粘合劑。（4) 一方面，封閉劑的主要組分是的纖維蛋白原、血漿蛋白和XIII因子，以及另一 方面是凝血酶和氯化鈣。組分通常提取自人血漿或通過重組技術產生?；旌侠w維蛋白原和 凝血酶產生聚合物屏障（纖維蛋白），聚合物屏障模擬天然凝血級聯的最后階段，以形成類 似于生理凝塊的結構化纖維蛋白凝塊。
[0007] 存在幾個可用的商業(yè)產品（Floseal、Gelfoam、Evicel、Bioglue、surgicel、 tachoseal等）（3,5)。然而，這些產品具有顯著的局限性，這阻礙了它們在手術中的嚴重出 血的情況下和急診醫(yī)學、整形外科和介入放射學以及腹腔鏡手術中的廣泛使用。用于腔內 出血的所有現有的止血劑被設計為用作輕度至中度出血中的助劑并且需要硬按壓。在開發(fā) 和/或使用用于最低限度的可按壓出血的組織粘合劑和封閉劑組合物中遇到的主要限制 之一是它們不能在大量出血時與組織形成足夠強的鍵合，和不能在應用10分鐘內產生穩(wěn) 定的凝塊。因此，組織粘合劑和封閉劑必須與按壓方法、縫合和/或縫釘和粘合劑貼片組合 使用，以便減少可接受的性能所需的組織鍵合強度。然而，有許多情況下，使用強按壓、縫合 和/或縫釘是不希望的、不恰當的或不可能的（例如，在骨、介入放射學中）。
[0008] 目前可選的方法：為了形成抵抗血液流動的物理屏障，粘合劑基質必須在幾秒鐘 內形成牢固的纖維蛋白界面，使之在流動的血液中與組織鍵合在一起，并保留在撕裂部位 以形成凝塊。每個產品以正方形、圓形貼附到球體、圓柱體或椎體的表示形式附著到人體組 織中的能力與組合物和生產纖維蛋白的方法以及它與凝血酶的相互作用（組合）以刺激凝 血級聯相關。該技術的重要方面是，繞過纖維蛋白原的裂解過程，以產生纖維蛋白單體和它 的隨后的聚合、凍干并能夠吸收血液以形成纖維蛋白凝塊的能力。該試劑的血塊形成過程 從已經穩(wěn)定的I型纖維蛋白聚合物開始，I型纖維蛋白聚合物將血液吸收到含有必要組分 的凍干交聯聚合物以刺激凝血級聯（凝血酶）并且形成物理屏障，物理屏障在應用的兩分 鐘內轉變成功能纖維蛋白凝塊。（6)
[0009] 在我們的方法中，這些結果通過以下步驟獲得：a)應用聚合交聯的凍干纖維蛋白 網絡，聚合交聯的凍干纖維蛋白網絡吸收血液以形成非常粘的凝膠狀基質，凝膠狀基質粘 附于撕裂組織；和b)結合凝血酶層，凝血酶層有助于快速形成牢固的纖維蛋白凝塊，纖維 蛋白凝塊由摻入在產品中的非鈣依賴的轉谷氨酰胺酶以及由血中的XIII因子穩(wěn)定。
[0010] 位于可生物降解的可去除的支持件上方的隨后的層的凍干過程促進它的應用，并 且允許長期貯存，運輸和準備。
[0011] 此外，尚未未開發(fā)基于纖維蛋白的產品來解決阻止深傷口或大血管床皮膚傷口出 血，這導致如此嚴重的出血而通常需要縫線或縫合。
[0012] 組合物。目前技術的所有形式一通過改變pH值來使酸溶液中的正方形、球體、圓 柱體或圓錐體結合的纖維蛋白單體，在活化的轉谷氨酰胺酶（非鈣依賴）和XIII因子（鈣 依賴）（鈣依賴和非鈣依賴）以及氯化鈣的存在下聚合，PH由緩沖溶液中和。一旦纖維蛋 白聚合物形成并且交聯，凝血酶的第二層即被結合并且隨后凍干。（圖1)
[0013] 單體可以與約1%至約5%體積的甘油混合，以實現適于應用的類型的特定的粘 彈性輪廓。通過塊狀物對血液的吸收使凍干纖維蛋白變成凝膠，該凝膠在損傷（7)的位點 處形成纖維蛋白凝塊。
[0014] 在凝結劑的條件下，血液中的非鈣依賴的轉谷氨酰胺酶和活化XIII因子通過由 共價鍵穩(wěn)定纖維蛋白凝塊而有助于該過程。
[0015] 關鍵屬性。聚合/粘合。封閉傷口的纖維蛋白凝膠是由凍干的雙層材料吸收血液 而形成，凍干的雙層材料從固體變?yōu)槟z狀態(tài)時保持共價鍵。凝塊是機械穩(wěn)定的，良好地 并入到傷口，并且與非交聯的凝塊[8]或其他纖維蛋白封閉劑相比，能更耐纖溶酶的溶解。 包括非鈣依賴的轉谷氨酰胺酶有利于轉谷氨酰胺酶介導的纖維蛋白中的aC-域聚合物的 交聯，從而促進整合素集群，并且從而增加細胞粘附和擴散，這刺激纖維蛋白結合內皮細胞
[9]上的avb3-、avb5-和a5bl整合素。寡聚反應還經由黏著斑激酶（FAK)和細胞外信號調 節(jié)激酶（ERK)促進整合素依賴的細胞信號傳導，這導致增加的細胞粘附和細胞迀移[10]。 鈣離子的存在增強了從炎性反應到凝血級聯（第一階段）的進程，并且激活XIII因子。
[0016] 已經在體外和體內對活體人體組織的粘附特性和推薦試劑的聚合動力學進行了 測試。獲得的數據提供ClotBlock止血的各種展示的能力的充分證據，并且以最小的按壓 實現實體器官或軟組織中的誘發(fā)的腹腔內傷口的止血。并且，在豬模型中，能停止膝關節(jié)和 髖關節(jié)置換中的髓內骨出血。凍干纖維蛋白II是由纖維蛋白II單體聚合獲得：美國專利申 請12/487057(授權）描述了制備纖維蛋白單體的方法。ClotBlock封閉劑組合物使用從纖 維蛋白單體的中和作用中獲得的凍干的纖維蛋白聚合物。本專利申請描述的纖維蛋白II的 部分的組合物和生產方法以及聚合物的中和與交聯的過程對所提出的技術的性能非常重 要，技術的性能取決于纖維蛋白本身的特性（纖維厚度、分支點數目、孔隙率和滲透性）以 及限定凝血因子的其它聚合特性。通過ClotBlock生成的凝塊產生厚纖維的不透明基質， 并且以比透明基質更快的速度進行管形成。凝血酶的濃度對于產生纖維蛋白單體，并且因 此FPA的釋放速率也對聚合過程具有重要的影響。為ClotBlock構建的所描述的濃度、稀 釋液和pH值以加快的速率產生最佳的纖維蛋白結構。ClotBlock介紹
[0017] 纖維蛋白聚合物可以以各種大小、厚度和形式生產和凍干，以適應于應用的類型 (圖2A、圖2B、圖2C)。它可以配置成1/4英寸直徑的小球體或圓柱體以通過腹腔鏡口或在 介入放射學中的血管被引入；它也可以模制成圓形或l/4、l/2al厚度的各種尺寸的正方形 平坦固體塊，用于脾臟裂傷或臟器切除，或放置在粘性繃帶上方以覆蓋深層皮膚切口。凍干 形式也可以浸泡在水中，并且用作封閉膏或凝膠。

【發(fā)明內容】

[0018] 本發(fā)明的領域在于生物粘合劑和組織封閉劑，生物粘合劑和組織封閉劑是可生物 降解和無毒的，旨在用于治療用途，例如，作為助劑用于剖腹或腹腔鏡手術的止血，或作為 矯形外科、創(chuàng)傷（脾裂傷）、介入放射學和大血管床傷口的主要治療。
[0019] -方面，本發(fā)明涉及生物相容性粘合劑纖維蛋白聚合物，其是生物可再吸收和無 毒的，用于外科或治療用途。它也涉及含有生物活性物質的雙層應用，它可以在給定的位點 釋放以刺激凝血。另一方面，本發(fā)明涉及一種用于生產這種粘合劑聚合物的工藝。
[0020] 大量的體內研究表明，ClotBlock對于控制中度至重度出血是很好的止血劑候選。 它的不同的展示最大化在各種類型的外科手術和創(chuàng)傷應用的止血效果。該試劑耐用，易于 儲存，造成最小的風險，需少量的培訓即可使用，并且是針對中度至重度出血是高效的。
【附圖說明】
[0021] 圖1示出了 ClotBlock層分布。
[0022] 圖2示出了可能的形狀：A球體和圓柱體；B貼片或塊；C繃帶。
[0023] 圖3示出了 Clotcake與T