步驟(I)中所述BSA溶液pH值4.0-9.0，優(yōu)選為7.0-9.0。
[0017]所述的一種共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑的制備方法，步驟
(3)中所述加入TRAIL與DOX的質(zhì)量比為10:1-1:10，優(yōu)選為5:1-1:5。
[0018]所述的一種共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑的制備方法，步驟
(3)中所述加入PEI和CMCS的質(zhì)量比為1:2-1:6，優(yōu)選為1:4。
[0019]共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑是由改良的去溶劑交聯(lián)法制備得到載阿霉素的白蛋白納米粒，再通過“Layer-By-Layer Self Assembly”技術(shù)將TRAIL裝載于白蛋白納米粒上，形成以白蛋白和阿霉素為核，羧甲基殼聚糖-葉酸偶合物為殼的白蛋白納米粒靶向制劑。白蛋白可以是人血清白蛋白，也可以是牛血清白蛋白。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點與效果是:
1.本發(fā)明制備的載藥白蛋白納米粒是一種乳白色膠狀溶液制劑，可用于肺癌、乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤的治療。
[0021]2.本發(fā)明所制得的共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒制劑，其具有葉酸受體靶向和腫瘤pH敏感釋藥的特性，注射后在血液循環(huán)中可以保持長時間的穩(wěn)定，說明羧甲基殼聚糖-葉酸偶聯(lián)物存在于納米粒的外層，利于納米粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。同時由于其掩蔽了PEI的正電荷，降低了納米粒的毒副作用。當(dāng)納米粒到達(dá)腫瘤部位時，其在葉酸介導(dǎo)下對腫瘤產(chǎn)生主動靶向，顯著提高了藥物在腫瘤部位的蓄積。腫瘤部位pH值低于正常細(xì)胞，納米粒子利用這一性質(zhì)，在腫瘤部位脫落外層的羧甲基殼聚糖外殼，釋放TRAIL，被細(xì)胞表面的TRAIL受體識別，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時，載體電荷發(fā)生翻轉(zhuǎn)，帶正電的載體更易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后釋放阿霉素，產(chǎn)生協(xié)同抗癌作用。
[0022]3.本發(fā)明通過工藝優(yōu)化和處方篩選成功地制備了共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒。透射電鏡觀察納米粒子具有球型外觀，平均粒徑在200納米左右。Zeta電位結(jié)果表明納米粒子的表面電荷隨著PEI和CMCS-FA的加入出現(xiàn)正負(fù)變換，說明采用層層自組裝技術(shù)成功構(gòu)建了納米粒子。
[0023]4.本發(fā)明制備的葉酸受體靶向和腫瘤pH敏感釋藥的載藥白蛋白納米粒靶向制劑，生物相容性好，制成注射劑后具有良好的緩釋性和腫瘤靶向性，可以提高阿霉素的治療效果，減少其使用的劑量，降低其毒副作用，益于提高患者治療的耐受性。
【附圖說明】
[0024]圖1為共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑的透射電鏡照片；
圖2為共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑的粒徑分布圖；
圖3為共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑制備過程中ζ -電位變化圖； 圖4a為共擔(dān)載阿霉素；
圖4b為TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑對不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用圖。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0026]實施例1制備共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑
(I)取BSA配成2%(克/毫升)的水溶液，用I摩爾每升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0。取BSA溶液I毫升，攪拌下向其滴加0.02%的鹽酸阿霉素乙醇溶液4毫升，加入速度10毫升/分，得到含藥的白蛋白溶液。然后，在攪拌下向含藥白蛋白溶液滴加4%的戊二醛乙醇溶液，繼續(xù)攪拌2小時后，轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)，在40°C真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20分鐘以除去乙醇。得到的產(chǎn)物經(jīng)10 0C,14000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10分鐘，棄去離心上清液，再用蒸餾水重復(fù)洗滌離心兩次，棄去上清液得到納米粒。然后向納米粒中添加蒸餾水，渦旋分散，得到載阿霉素的白蛋白納米粒。
[0027](2)取0.2 g葉酸(FA)溶于10毫升的二甲基亞砜中，加入0.1 g的NHS和0.2 g的DCC，其中？六/順5/1)(1:摩爾比為1:2:2，室溫活化12小時，直到葉酸全部溶解。向葉酸溶液中加入1%的羧甲基殼聚糖(CMCS)的磷酸鹽緩沖液和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，其中CMCS的粘均分子量為50 kDa，脫乙酰度85%，羧甲基取代度60%，CMCS/FA/EDC摩爾比為1:1:1。繼續(xù)室溫避光攪拌16小時，得到反應(yīng)液。然后向反應(yīng)液中滴加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9.0，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液透析24小時，然后用水透析24小時后，凍干處理，得羧甲基殼聚糖-葉酸偶聯(lián)物(CMCS-FA)ο
[0028](3)取載阿霉素的白蛋白納米粒溶液I毫升，向其中加入0.25% PEI水溶液0.1毫升使納米粒表面電荷由負(fù)變正，其中PEI分子量20 kDa，攪拌混勻后加入10微克/毫升的TRAIL溶液I毫升，攪拌均勻后再加入1.5毫克/毫升的CMCS-FA溶液(pH8.0磷酸鹽緩沖液配制)0.5毫升使納米粒電荷由正變負(fù)，室溫攪拌30分鐘，即得共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒。
[0029]通過這種方法制備的納米粒為球狀微粒，粒徑分布較均勻，平均粒徑在200納米左右(附圖1、2)。ζ-電位結(jié)果顯示(附圖3)，納米粒表面電荷有明顯翻轉(zhuǎn)的過程，即原來的BSA納米粒表面荷負(fù)電，PEI加入后電荷變正，而CMCS-FA加入后電荷又由正變負(fù)(附圖3)，說明納米粒是以BSA為核心，PEI和CMCS-FA共同組成納米粒的外殼，通過層層組裝而成。
[0030]實施例2制備共擔(dān)載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑
(I)取BSA配成1%(克/毫升)的水溶液，用I摩爾每升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0。取BSA溶液I毫升，攪拌下向其滴加0.01%的阿霉素乙醇溶液4毫升，加入速度10毫升/分，得到含藥的白蛋白溶液。然后，在攪拌下向含藥白蛋白溶液滴加4%的戊二醛乙醇溶液，繼續(xù)攪拌2小時后，轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)，在40°C真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20分鐘以除去乙醇。得到的產(chǎn)物經(jīng)10 0C,14000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10分鐘，棄去離心上清液，再用蒸餾水重復(fù)洗滌離心兩次，棄去上清液得到納米粒。然后向納米粒中添加蒸餾水，渦旋分散，得到載阿霉素的白蛋白納米粒。
[0031](2)取0.2 g葉酸(FA)溶于10毫升的二甲基亞砜中，加入0.1 g的NHS和0.2 g的DCC，其中FA/NHS/DCC摩爾比為1:2: 2，室溫活化12小時，直到葉酸全部溶解。向葉酸溶液中加入1%的羧甲基殼聚糖(CMCS)的磷酸鹽緩沖液和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，其中CMCS的粘均分子量80 kDa，脫乙酰度85%，羧甲基取代度80%，CMCS/FA/EDC摩爾比為1:1:1。繼續(xù)室溫避光攪拌16小時，得到反應(yīng)液。然后向反應(yīng)液中滴加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9.0，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液透析24小時，然后用水透析24小時后，凍干處理，得羧甲基殼聚糖-葉酸偶聯(lián)物(CMCS-FA)ο
[0032](3)取載阿霉素的白蛋白納米粒溶液I毫升，向其中加入0.25% PEI水溶液0.1毫升使納米粒表面電荷由負(fù)變正，其中PEI分子量25 kDa,攪拌混勻后加入100微克/毫升的TRAIL溶液I毫升，攪拌均勻后再加入1.5毫克/毫升的CMCS-FA溶液(pH8.0磷酸鹽緩沖液配制)I毫升使納米粒電荷由正變負(fù)，室溫攪拌30分鐘，即得。
[0033]實施例3制備葉酸受體革巴向和腫瘤pH敏感釋藥的載藥白蛋白納米粒
(I)取BSA配成5%(克/毫升)的水溶液，用I摩爾每升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0。取BSA溶液I毫升，攪拌下向其滴加0.05%的阿霉素乙醇溶液4毫升，加入速度10毫升/分，得到含藥的白蛋白溶液。然后，在攪拌下向含藥白蛋白溶液滴加4%的戊二醛乙醇溶液，繼續(xù)攪拌2小時后，轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)，在40°C真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20分鐘以除去乙醇。得到的產(chǎn)物經(jīng)10 0C,14000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10分鐘，棄去離心上清液，再用蒸餾水