一種高效抗炎性pb odn序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種高效抗炎性PB ODN序列及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 國內(nèi)眾多獸用抗炎性藥物都主要依靠抗生素，但長期使用抗生素，會導(dǎo)致嚴(yán)重的 耐藥性，目前國內(nèi)外眾多企業(yè)已經(jīng)開始限制使用多種抗生素，抗生素的濫用也極大程度限 制了我國肉類食品的出口。另外一個預(yù)防獸類疾病的手段就是利用疫苗。但多種病原菌的 血清型眾多，疫苗交叉反應(yīng)，保護(hù)效果差。因此急需一種新型安全的抗炎性制劑。
[0003] 益生菌DNA是益生菌能夠抑制多種炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)因素，其中存在特定的益 生基序（Probiotics Motif)。益生菌DNA中益生基序的篩選與此前從大腸桿菌DNA中篩 選CpG基序具有異曲同工之處。這里，我們?yōu)榱藚^(qū)別其與哺乳動物來源的抑制性寡核苷酸 (Suppressive oligodeoxynucleotide，Sup 0DN)，將益生菌 DNA 的益生基序命名為益生 ODN (Probiotics oligodeoxynucleotide，PB 0DN)。細(xì)菌 DNA 能夠通過非甲基化 CpG 序 列作用于宿主免疫系統(tǒng)的TLR9受體，促使B細(xì)胞增殖，誘發(fā)強(qiáng)烈的Thl炎性反應(yīng)，增強(qiáng)抗原 抗體反應(yīng)，因此，細(xì)菌DNA早期也被應(yīng)用于感染治療。后來，Krieg等篩選出細(xì)菌DNA中的 CpG序列（嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶)，進(jìn)而人工合成含有CpG序列的寡具脫氧核酸（CpG oligodeoxynucleotide, CpG 0DN)，并證實免疫效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)菌DNA，由此開創(chuàng)了 CpG預(yù) 防細(xì)菌感染和治療癌癥的光輝歷史。
[0004] 相類似的，2000年，Pisetsky等發(fā)現(xiàn)哺乳動物的DNA具有免疫抑制功能。繼而發(fā) 現(xiàn)了 Sup ODN序列，近來人類微衛(wèi)星DNA和線粒體DNA等哺乳動物保守區(qū)域都成為了新的 Sup ODN的研究位點(diǎn)，從此掀開了抑制性O(shè)DN研究的熱潮。
[0005] 2012年，Bouladoux發(fā)現(xiàn)Sup基序大量存在于益生菌DNA中，而且認(rèn)為此前很多有 關(guān)益生菌DNA在炎癥治療方面的研究可能最終起作用的就是DNA中存在的Sup基序。認(rèn)為 在益生菌DNA中存在一類全新的免疫調(diào)芐基序，而且具有調(diào)控炎癥反應(yīng)，恢復(fù)免疫微環(huán)境 平衡的功能，申請人對益生菌DNA進(jìn)行了大量篩選分析工作，發(fā)現(xiàn)其中存在類似"ACTTGG" 為特征的高重復(fù)率的PB ODN基序，經(jīng)過驗證，確定具有明顯的炎癥調(diào)控能力。因此，從益生 菌DNA中篩選出具有明顯炎癥抑制活動的特征序列，不僅可以為益生菌的開發(fā)利用研究提 供更多信息，也可以控制多種病原體感染后炎癥，具有可觀的研究前景和價值；但是目前還 沒有PB ODN的相關(guān)文獻(xiàn)及用于防治豬炎癥的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種高效安全 的抗炎癥PB ODN序列。
[0007] 本發(fā)明是第二個目的是提供含有上述PB ODN序列的PB ODN制劑，基于所述制劑， 可成功替代或部份替代抗生素，避免疫苗保護(hù)效果不全面的目的。
[0008] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述PB ODN制劑的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的： 一種高效抗炎的PB ODN序列，如SEQ ID NO :1所示。本發(fā)明從益生菌DNA中篩選獲得 了一種PB ODN序列，該序列具有高效抗炎作用。
[0010] 本發(fā)明所述PB ODN序列獲得方法如下：通過對絕大部分大腸桿菌和乳酸桿菌的 保守重復(fù)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)"CCAAGG"和"CCAAGC"可能是兩類潛在的抑制性基序，并參 照Bouladoux的方法，從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得28種乳酸桿菌的基因組、27種大腸桿菌的基 因組、金黃色葡萄球菌基因組、豬微衛(wèi)星DNA、豬線粒體DNA和豬端粒酶DNA等近100個基 因組，借助"fuzznuc"在線分析軟件分析上述基序的拷貝數(shù)，再參照胡大利等(胡大利等， 2007)篩選方法進(jìn)行ODN活性篩選得到。
[0011] 在使用前，本發(fā)明所述PB ODN序列需經(jīng)過硫代化，硫代化處理為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。
[0012] 本發(fā)明還提供含有上述PB ODN序列的制劑(簡稱為PB ODN制劑);具體的，可以將 經(jīng)硫代化后的PB ODN序列用無菌PBS溶液配制濃度為10~lOOPg/ml，保存于-15~-25°C。
[0013] 優(yōu)選地，所述PBS溶液的組成為：按照重量百分比計，0. 6~I. 0% NaCl、0. 01~ 0· 04% KC1、0. 0124 ~0· 0164% Na2HP04、0. 014 ~0· 034% KH2PO4,在 115 ~121Γ 下，滅菌 15 ~25min〇
[0014] 具體地，所述滅菌可以采用濕熱高壓滅菌法，其操作可以參照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。
[0015] 本發(fā)明還提供所述PB ODN序列在制備治療或預(yù)防豬疾病的制劑中的應(yīng)用。
[0016] 更優(yōu)選地，所述豬疾病為由豬嗜血桿菌引起的疾病。
[0017] 本發(fā)明還提供上述制劑在治療和/或預(yù)防豬疾病中的應(yīng)用，具體地，當(dāng)用于治療 時，是在豬的疾病發(fā)病后，立即按每公斤豬重量皮下注射〇. 2~Iml PB ODN制劑，3~7天 后再次給藥；當(dāng)用于預(yù)防時，是在豬的疾病發(fā)病高峰期前一周，按每公斤動物重量皮下注射 0· 1~0· 5ml PB ODN制劑，3~7天后再次給藥。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了一種高效抗炎的PB ODN序列及其應(yīng)用，該序列具有高效抗炎作用；含有 該序列的制劑非常有利于控制豬疾病和炎癥，可成功替代或部份替代抗生素，從而降低抗 生素及疫苗的使用量；使動物類食品更加安全，符合綠色環(huán)保的要求，有利于降低養(yǎng)殖動物 生產(chǎn)企業(yè)的成本，也能提高養(yǎng)殖企業(yè)的養(yǎng)殖效率。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。 在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換， 均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知 的常規(guī)手段。
[0020] 實施例1 PB ODN的序列（SEQ ID N0:l):5'- TCCAAGTACTTGGACTTGG-3'，可采用現(xiàn)有基因工程或 化學(xué)方法合成，該序列均經(jīng)硫代化處理(硫代化處理可以參考本領(lǐng)域的常規(guī)工藝進(jìn)行)。合 成后，用無菌PBS溶液配制成l(^g/ml的制劑（PB ODN制劑)，保存于-15°C備用。
[0021] 所述PBS溶液組成為：按照重量百分比計，0. 6%的NaCl、0. 01%的KC1、0. 0124%的 Na2HP04、0. 014%的KH2PO4溶于水中；然后米用濕熱高壓滅菌法在115°C下，滅菌20min。濕 熱高壓滅菌法是本領(lǐng)域常用的滅菌方法，其操作可以參照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。
[0022] 預(yù)防：在豬的疾病發(fā)病高峰期前一周，按每公斤動物重量皮下注射0.1 ml所述PB ODN制劑，3天后再次給藥。
[0023] 治療：在豬的疾病的發(fā)病后，立即按每公斤動物重量皮下注射0. 2ml所述PB ODN 制劑，3天后再次給藥。
[0024] 實施例2 PB ODN的序列（SEQ ID N0:l):5'- TCCAAGTACTTGGACTTGG-3'，可采用現(xiàn)有基因工程或 化學(xué)方法合成，該序列均經(jīng)硫代化處理(硫代化處理可以參考本領(lǐng)域的常規(guī)工藝進(jìn)行)。合 成后，用無菌PBS溶液配制成3(^g/ml的制劑（PB ODN制劑)，