一種高穩(wěn)定性的檸檬桉精油納米脂質(zhì)體抗菌劑及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗菌劑及藥物制劑或者化妝品領(lǐng)域，具體涉及一種高穩(wěn)定性的檸檬桉 精油納米脂質(zhì)體抗菌劑及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 梓檬桉(學(xué)名JwcaXrjOto?ci(rioobra，科名：桃金娘科，屬名：桉屬）原產(chǎn)于澳 大利亞，20世紀(jì)20年代中期中國將其引進(jìn)，目前在廣東、廣西、四川、云南等省區(qū)已有大 量栽培；從檸檬桉葉中提取、純化出的檸檬桉葉油，主要活性成分為香茅醛，這種精油具 有令人愉快的香味，已在香精、香料、肥皂、化妝品及食品等行業(yè)中廣泛使用；研究表明檸 檬桉精油中的揮發(fā)性成分對(duì)植物病原性真菌有抑制效果，其中，香茅醛對(duì)金黃色葡萄球菌 ayrei/61)和枯草芽抱桿菌具有比較明顯的抑制效 果，利用檸檬桉精油開發(fā)天然抗菌劑，對(duì)于食品的保鮮具有十分重要的意義。
[0003] 國內(nèi)外關(guān)于檸檬桉的專利申請(qǐng)很少；CN102942461A公開了一種檸檬桉油單離香 茅醛的方法，CN102860303A公開了一種利用檸檬桉葉油提取廢液制備蚊子驅(qū)避劑的方法， CN101880600A公開了一種提取檸檬桉葉揮發(fā)油及3, 8-二醇的方法。
[0004]雖然檸檬桉精油具有較好的抗菌性能，但是檸檬桉精油的提取全部來自純天然植 物，不添加任何人工合成的防腐劑等，因此其化學(xué)成分極其脆弱，并會(huì)受到空氣、陽光等自 然環(huán)境的影響而變質(zhì)，而且，檸檬桉精油中易揮發(fā)物質(zhì)含量較高，在使用過程中極易揮發(fā)， 從而會(huì)降低檸檬桉精油的使用率，造成資源浪費(fèi)，因此有必要尋找有效地方法改善這些問 題。
[0005]本專利發(fā)明了一種檸檬桉精油納米脂質(zhì)體的制備方法，納米脂質(zhì)體是一種由兩性 類脂質(zhì)形成的具有類似生物膜雙分子層的微型囊泡，因此，脂質(zhì)體具有良好的生物相容性， 并且納米脂質(zhì)體不會(huì)對(duì)檸檬桉精油的主要活性成分造成破壞；納米脂質(zhì)體能夠有效地保護(hù) 包裹在內(nèi)的檸檬桉精油，避免了精油的揮發(fā)，而且減少了光對(duì)精油的作用，另外，納米脂質(zhì) 體具有良好的靶向性，可以靶向到特定的細(xì)菌釋放被包裹的精油，從而增加精油的殺菌性 能和生物利用性；但由于脂質(zhì)體的緩釋作用，包裹精油的脂質(zhì)體保質(zhì)期受限，所以，本專利 選用了殼聚糖和明膠制成穩(wěn)定性高的多層脂質(zhì)體，檸檬桉精油多層納米脂質(zhì)體的制備有效 地提高了精油的利用率，延長(zhǎng)了脂質(zhì)體的貯藏期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是公開一種高穩(wěn)定性的檸檬桉精油納米脂質(zhì)體及其制備方法，通過 將檸檬桉精油包裹在多層納米脂質(zhì)體中，以實(shí)現(xiàn)減少檸檬桉精油在使用過程中的揮發(fā)，從 而減少檸檬桉精油的浪費(fèi)，達(dá)到長(zhǎng)效抗菌與高效利用的目的。
[0007]-種高穩(wěn)定性的檸檬桉精油納米脂質(zhì)體，檸檬桉精油包裹在磷脂雙分子層中，其 特征在于：磷脂雙分子層為第一層納米脂質(zhì)體，還設(shè)有第二層納米脂質(zhì)體，第二層由殼聚糖 組成。
[0008] 進(jìn)一步地，所述的一種高穩(wěn)定性的檸檬桉精油納米脂質(zhì)體，其特征在于：還設(shè)有第 三層納米脂質(zhì)體，第三層由明膠組成。
[0009] 進(jìn)一步地，第二層納米脂質(zhì)體中殼聚糖的濃度為0? 2mg/mL。
[0010] 進(jìn)一步地，第三層納米脂質(zhì)體中明膠的濃度為0. 4mg/mL。
[0011] 大豆卵磷脂、膽固醇是構(gòu)成脂質(zhì)體的組要成分，膽固醇均有調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性的作用， 所以考察其兩者的配比變化，對(duì)構(gòu)成的脂質(zhì)體分散性等參數(shù)有無影響；表面活性劑是增加 脂質(zhì)體穩(wěn)定性；檸檬桉精油濃度是根據(jù)包封率來確定的；醋酸鹽溶液的PH是為了最佳溶解 殼聚糖；殼聚糖和明膠都可以增加穩(wěn)定性。
[0012] 本發(fā)明的制備方法是將檸檬桉精油，大豆卵磷脂，膽固醇混合于有機(jī)溶劑，減壓蒸 干形成光滑的薄膜，加入水相介質(zhì)和表面活性劑組成的混合溶液溶解薄膜并超聲成乳、離 心后取上層液體過濾得到單層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體，其特征在于：將單層檸檬桉精油納 米脂質(zhì)體與殼聚糖溶液攪拌均勻，通過離心和微孔濾膜過濾，得到粒徑為納米級(jí)的雙層檸 檬桉精油納米脂質(zhì)體。
[0013] 進(jìn)一步地，將雙層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體與明膠溶液攪拌均勻，通過離心和微孔 濾膜過濾，得到粒徑為納米級(jí)的多層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體。
[0014] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的大豆卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比例為5:1;表面活性劑、檸檬桉 精油與膽固醇的質(zhì)量比為：1:5:4,此條件下可以得到最高的包封率。
[0015] 進(jìn)一步地，表面活性劑為PVP，混合溶液中PVP的濃度為L(zhǎng)0mg/mL。
[0016] 單層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體與殼聚糖溶液的體積比為1:10;雙層檸檬桉精油納 米脂質(zhì)體與明膠溶液的體積比為1:10。
[0017] 本發(fā)明中所述的有機(jī)溶劑是氯仿。
[0018] 本發(fā)明中所用的水相介質(zhì)是根據(jù)中國藥典2000版標(biāo)準(zhǔn)配制的醋酸鹽緩沖溶液， pH值 3. 5~4. 0。
[0019] 所述的殼聚糖溶液為殼聚糖的醋酸鹽溶液，濃度為0.2mg/mL，醋酸鹽溶液是根 據(jù)中國藥典2000版標(biāo)準(zhǔn)配制的醋酸鹽緩沖溶液，pH值3. 5~4. 0,優(yōu)選3. 6,能夠最佳溶解殼 聚糖。
[0020] 所述明膠溶液為明膠的醋酸鹽溶液，濃度為0. 4mg/mL，醋酸鹽溶液是根據(jù)中國藥 典2000版標(biāo)準(zhǔn)配制的醋酸鹽緩沖溶液，pH值3. 5~4. 0。
[0021] 本發(fā)明中脂質(zhì)體的第一層是磷脂雙分子層，即人工細(xì)胞膜層。
[0022] 本發(fā)明中脂質(zhì)體的第二層由殼聚糖組成，濃度為0. 2mg/mL。
[0023] 本發(fā)明中脂質(zhì)體的第三層由明膠組成，濃度為0.4mg/mL。
【附圖說明】
[0024]圖1為檸檬桉精油納米脂質(zhì)體的包封率。
[0025]圖2為檸檬桉精油納米脂質(zhì)體的粒徑與多分散系數(shù)roi。
[0026]圖3為多層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體熒光顯微圖。
[0027]圖4為多層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體原子力顯微圖。
[0028]圖5多層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體對(duì)大腸桿菌的抗菌性能。
[0029]圖6多層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌性能。
[0030] 表1為檸檬桉精油納米脂質(zhì)體的Zeta電位。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 通過下面實(shí)例說明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容，不僅局限于此。
[0032] 實(shí)施例1多層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體的包封率 1實(shí)驗(yàn)材料 大豆卵磷脂；BR;國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0033] 膽固醇；AR;國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0034] 三氯甲烷；AR;國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0035] 檸檬桉精油；AR;法國fIorihana精油。
[0036] PVP;GR;國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0037] 殼聚糖；BR;國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0038] 明膠；BR;國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0039] 2實(shí)驗(yàn)方法 1)單層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體的制備 ①稱取Ig大豆卵磷脂，0.2g膽固醇和250mg的檸檬桉精油，加50mL氯仿使其溶解。
[0040] ②在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)至溶劑蒸干，蒸發(fā)溫度為10~30 °C，圓底燒瓶?jī)?nèi)壁會(huì)形 成光滑的薄膜；然后將所得產(chǎn)品放入真空干燥箱中，30 °C，真空狀態(tài)下干燥24小時(shí)。
[0041] ③稱取0.05g的PVP于醋酸鹽緩沖液中，超聲波條件下擴(kuò)散，然后將PVP的醋 酸鹽緩沖液加入圓底燒瓶中超聲波條件下進(jìn)行水化。
[0042] ④將水化后的混合液于細(xì)胞超微粉碎儀中以工作10s，間隙5s的頻率粉碎 30min〇
[0043] ⑤將所得產(chǎn)品進(jìn)行離心，4000rpm，15min，取上層液體D
[0044] ⑥將所得液體用0.22ym濾膜進(jìn)行過濾，得濾液，為單層檸檬桉精油納米脂質(zhì) 體。
[0045] 2)雙層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體的制備 ①按照上述單層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體的制備方法，制備含250mg檸檬桉精油的單 層納米脂質(zhì)體。
[0046] ②將單層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體分散在含0. 2mg/mL殼聚糖的醋酸鹽溶液中混 合均勻；單層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體與殼聚糖的醋酸鹽溶液的體積比1 :10。
[0047] ③將所得混合液于細(xì)胞超微粉碎儀中以工作10s，間隙5s的頻率粉碎30 min〇
[0048] ④將所得產(chǎn)品進(jìn)行離心，4000rpm，15min，取上層液體。
[0049] ⑤將所得液體用0.22ym濾膜進(jìn)行過濾，得濾液，為雙層檸檬桉精油納米脂質(zhì) 體。
[0050] 3)多層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體的制備 ①按照上述雙層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體的制備方法，制備含250mg檸檬桉精油的雙 層納米脂質(zhì)體。
[0051] ②將雙層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體分散在含0.4mg/mL明膠的醋酸鹽溶液中使其 混合均勻；雙層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體與明膠的醋酸鹽溶液的體積比為1 :1〇。
[0052] ③將所得混合液于細(xì)胞超微粉碎儀中以工作10s，間隙5s的頻率粉碎30 min〇
[0053] ④將所得產(chǎn)品進(jìn)行離心，4000rpm，15min，取上層液體。
[0054] ⑤將所得液體用0.22ym濾膜進(jìn)行過濾，得濾液，為多層檸檬桉精油納米脂質(zhì) 體。
[0055] 4)包封率的測(cè)定 用無水乙醇稀釋檸檬桉精油，逐級(jí)稀釋成濃度分別為0.l、〇. 2、0. 4、0. 6、0. 8mg/mL的 標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后，分別吸取IyL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行GC-MS分析，對(duì)其主要成分香茅醛的譜峰面 積進(jìn)行自動(dòng)積分，繪制香茅醛峰面積_檸檬桉精油濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；首先取ImL檸檬桉精油納 米脂質(zhì)體樣品，13500rpm，離心3h，倒掉上清液。接著加入ImL乙醇破乳劑，超聲3h，最 后以10000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min，取上清液，用于GC-MS分析，制備好的脂質(zhì)體樣品，對(duì)精 油主成分的峰面進(jìn)行自動(dòng)積分，再根據(jù)步驟1中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出脂質(zhì)體中植物精 油的含量。
[0057] 3檸檬桉精油納米脂質(zhì)體的包封率 包封率是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體制劑質(zhì)量好壞的最重要的指標(biāo)，也是脂質(zhì)體能否發(fā)揮較普通制劑 尚效、低毒等特點(diǎn)的關(guān)鍵；由圖1可看出，單層朽1彳冡按精油納米脂質(zhì)體的包封率為22. 1%，雙 層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體的包封率為47. 3%，多層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體的包封率最大，為 86. 7%，因此制備多層檸檬桉精油納米脂質(zhì)體可以明顯提