一種包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒及其制備方法和應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于納米藥物載體技術(shù)領域，涉及一種包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒的制備 方法和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是世界上死亡率較高的疾病，化療是其主要治療手段之一。順鉑（Cisplatin) 是一種重要的抗腫瘤劑，它被廣泛應用于許多惡性腫瘤的臨床治療，如睪丸癌，卵巢癌，膀 胱癌，頭頸部鱗癌，小細胞和非小細胞肺癌等。然而，隨著順鉑在臨床上的使用越來越廣泛， 臨床上的耐藥性也逐漸凸顯，順鉑作為比較好的化療藥物慢慢顯示出其局限性。而且順鉑 在臨床上使用的過程中也有很多的毒副作用，比如腎毒性、神經(jīng)毒性、感知能力下降等。
[0003] 針對小分子藥物在臨床治療中出現(xiàn)的一些毒副作用和耐藥性，人們將目光轉(zhuǎn)向納 米藥物載體。納米藥物載體現(xiàn)己成為研究的熱門領域，因為它能夠克服傳統(tǒng)小分子藥物在 化療中的諸多缺點，例如非特異性的分布、靶向性較差、水溶性不好和不理想的抗腫瘤效果 等。這些納米材料可以被設計用來攜帶多種抗腫瘤藥物，它們通過調(diào)控自身的尺寸和表面 性質(zhì)可以改變小分子藥物在體內(nèi)的分布、循環(huán)時間和抗腫瘤活性等性質(zhì)。
[0004] 之前研究的熱點多集中于有機納米藥物載體。但近年來，隨著納米技術(shù)研究的不 斷深入，無機納米磷酸鈣已成為熱門的研究領域之一。鑒于納米磷酸鈣作為無機納米材料 物獨特優(yōu)勢，人們開始考慮是否可以將納米磷酸鈣與納米藥物載體結(jié)合起來。磷酸鈣納米 材料作為藥物遞送載體，其自身具有諸多優(yōu)勢如：
[0005] 1、磷酸鈣作為人體的重要組成成分，具有安全無毒的特點；
[0006] 2、納米磷酸鈣藥物載體是pH響應性的，腫瘤組織細胞內(nèi)的酸性環(huán)境可以使磷酸 鈣降解進而誘導藥物釋放；
[0007] 3、納米磷酸鈣藥物載體具有更好的生物相容性和生物體內(nèi)的穩(wěn)定性。
[0008] 盡管磷酸鈣具有如此多的優(yōu)勢，但是近年來關(guān)于磷酸鈣納米顆粒包埋順鉑的研究 比較少，而且在現(xiàn)有的研究中一般將順鉑分散在磷酸鈣的表面。這樣的話，在未到達腫瘤組 織之前，順鉑在體內(nèi)運輸?shù)倪^程中就會釋放，從而降低了對腫瘤細胞的殺傷效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明旨在用磷酸鈣作為載體將順鉑包埋在磷酸鈣層里面，這樣可以抑制 順鉬在體內(nèi)運輸過程中的釋放，并且可通過實體瘤的高通透性和滯留效應（enhanced permeabilityandretentioneffect，EPR)聚集在腫瘤組織附近，而在腫瘤組織的酸性環(huán) 境下又可以將順鉑釋放從而提高對腫瘤細胞的殺傷效率。
[0010] 本發(fā)明解決技術(shù)問題，采用如下技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明所提供的包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒是在親水性嵌段共聚物PEG-PAA的 基礎上在水相中通過離子膠束成核的方法制備的。其制備方法的特點在于：首先合成可 逆加成 _ 斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合試劑ETP(2_(Ethylsulfanylthiocarbonylsulfanyl)propionic acid，S-乙基-S' - (a-甲基-a' -乙酸）三硫代碳酸酯），然后用ETP與聚乙二醇5000單甲 醚反應生成大分子引發(fā)劑ETP-PEG5k，再使偶氮二異丁腈的催化作用下引發(fā)單 體丙烯酸聚合，獲得親水性嵌段共聚物PEG-PAA;
[0012] 親水性嵌段共聚物PEG-PAA的部分羧基與順鉑發(fā)生配位結(jié)合使順鉑接在親水性 嵌段共聚物PEG-PAA上，然后使用鈣離子膠束成核的方法使親水性嵌段共聚物PEG-PAA形 成膠束，最后膠束再與磷酸根結(jié)合形成磷酸鈣礦物層，使得順鉑被磷酸鈣層包埋，即獲得包 埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒；
[0013] 所述ETP的結(jié)構(gòu)式如式⑴所示：
[0017] 本發(fā)明包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒的制備方法的具體步驟為：
[0018] A、合成可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合試劑ETP:
[0019] 將24. 852g乙硫醇和60mL蒸餾水混合并攪拌，在冰浴條件下緩慢滴加32g質(zhì)量 濃度為50 %的NaOH溶液，再加入20mL丙酮并攪拌30min，再加入34. 2g二硫化碳并攪拌 30min;然后緩慢滴加62. 73g2-溴丙酸，再緩慢滴加32g質(zhì)量濃度為50 %的NaOH溶液；當 放熱停止后，移除冰?。蝗缓蠹尤?0mL蒸餾水，在室溫條件下反應24h;反應結(jié)束后，再在冰 浴條件下加入60mL蒸餾水，慢慢用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2,所得到的油狀物用二氯甲烷萃取3 次，旋蒸除去二氯甲烷，然后用正己烷進行重結(jié)晶，所得淡黃色晶體即為ETP;
[0020] B、合成大分子引發(fā)劑ETP-PEG5k:
[0021] 取2. 1034g步驟A所獲得的ETP溶解于IOmL甲苯中，獲得ETP溶液；
[0022] 取5g聚乙二醇5000單甲醚溶解在20mL甲苯中，然后加入2. 2693g二環(huán)己基碳二 亞胺（DCC)和12. 95mg4-二甲氨基吡啶（DMAP)，再用恒壓滴液漏斗滴加ETP溶液，并反應 12h;反應結(jié)束后，過濾掉所產(chǎn)生的沉淀二環(huán)己基脲（DCU);旋蒸除去部分甲苯，然后在冰乙 醚中沉淀，所得固體粉末旋干，即為ETP-PEG5k;
[0023] C、合成親水性嵌段共聚物PEG-PAA
[0024] CU丙烯酸于室溫條件下用氫化鈣干燥24小時，然后減壓蒸餾；
[0025] C2、將 2. 1616gETP-PEG5kU. 5 ~3g丙烯酸（AA)、和 13. 67mg偶氮二異丁腈（AIBN) 溶解在30mL1，4-二氧六環(huán)中，冰浴條件下通干燥的N230min;移至60°C油浴鍋中，反應 24h;反應結(jié)束后，所得溶液在蒸餾水中透析一周，透析完成后凍干，即得親水性嵌段共聚物 PEG-PAA；
[0026] D、制備包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒
[0027] 將IOmg順鉑（CDDP)和IImgAg2NO3溶解在IOmL蒸餾水中，在避光條件下攪拌4h， 離心、過濾去除沉淀，獲得順鉑溶液；
[0028] 將44.6mg步驟C所獲得的親水性嵌段共聚物PEG-PAA溶解在15mL蒸餾水中，并 用IMNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8,然后加入到所述順鉑溶液中，37°C水浴條件下避光反應12h;然 后加入1.3351^0.邡0&(勵3) 2溶液并攪拌反應511，再加入2.6701^0.邡恥2即04溶液，繼 續(xù)攪拌l〇h，對所獲得的溶液透析24h，透析后凍干，即可得到目標產(chǎn)物包埋順鉑的磷酸鈣 納米顆粒。
[0029] 按照上述制備方法所制備的包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒的直徑在IOOnm左右。
[0030] 本發(fā)明制成的包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒的尺寸大小、物理化學性能可通過親水 性嵌段共聚物的分子量及其組成變化而調(diào)節(jié)。本發(fā)明中包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒的優(yōu)點 在于：
[0031] 1、合成方法簡單且可控；
[0032] 2、PEG在磷酸鈣納米顆粒的外端，除了可提供磷酸鈣納米顆粒的水溶性外，還可延 長其在體內(nèi)的循環(huán)時間；而且羧基處于整個共聚物的分子骨架，順鉑可與羧基發(fā)生配位結(jié) 合從而提高藥物的載藥率；
[0033] 3、水相中合成：合成遞送藥物用的納米藥物載體的普遍方法涉及到有機溶劑，而 本發(fā)明中的磷酸鈣納米顆粒在水相中制備無任何有機溶劑、制備條件溫和；
[0034] 4、包埋順鉑藥物的磷酸鈣納米顆粒具有更好的生物相容性、顆粒穩(wěn)定性和pH響 應性，包埋順鉑藥物的磷酸鈣納米顆粒在體內(nèi)血液循環(huán)時pH7. 4的條件下盡量保證藥物 不釋放，但到達腫瘤組織細胞的酸性環(huán)境可以誘導藥物釋放，所以該包埋順鉑的磷酸鈣納 米顆粒可作為順鉑藥物的載體，實現(xiàn)藥物的可控釋放。
【附圖說明】
[0035] 圖1為ETP的合成路線；
[0036] 圖2為大分子引發(fā)劑ETP-PEG5k的合成路線；
[0037] 圖3為親水性嵌段共聚物PEG-PAA的合成路線；
[0038]圖 4 為ETP、ETP-PEG5k、親水性嵌段共聚物PEG-PAA的1HNMR;
[0039] 圖5為親水性嵌段共聚物PEG-PAA的GPC譜；
[0040] 圖6為包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒（CaPNP/⑶DP)的粒徑分布、透射電鏡圖；
[0041] 圖7為包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒（CaPNP/CDDP)的元素分布（Element mapping)圖；
[0042] 圖8為包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒（CaPNP/⑶DP)的穩(wěn)定性圖；
[0043] 圖9為包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒（CaPNP/CDDP)的TG圖；
[0044] 圖10為包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒（CaPNP/⑶DP)的體外釋放實驗；
[0045] 圖11為包埋順鉑的磷酸鈣納米顆粒（CaPNP/⑶DP)的細胞毒性實驗。
【具體實施方式】
[0046] 本發(fā)明提供了一種包埋順鉑藥物的磷酸鈣納米藥物載體。此磷酸鈣納米藥物載體 由親水性嵌段共聚物PEG-PAA通過離子成核的方法制備而成。所以在制備磷酸鈣納米顆粒 之前要先合成親水性嵌段共聚物PEG-PAA。該發(fā)明中的親水性嵌段共聚物PEG-PAA為聚乙 二醇單甲醚-聚丙烯酸（PAA)。其嵌段共聚物包括聚乙二醇單甲醚（mPEG5K，A嵌段）和聚 丙烯酸（PAA，B嵌段）。所以上述嵌段共聚物聚乙二醇單甲醚-聚丙烯酸表示為PEG-P