一種人β-防御素-1在制備治療或預(yù)防乙型肝炎病毒感染藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗病毒藥物領(lǐng)域，涉及一種人β -防御素-1 ( β -defensin-1, hBDl)的新用途，更具體涉及一種人β-防御素-1在制備治療或預(yù)防乙型肝炎病毒(ifepatitis Bvirus，HBV)感染藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是引起肝癌的主要因素之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。我國是乙型肝炎病毒感染的高發(fā)區(qū)，約有1.2億慢性乙肝患者，每年約有30萬人死于慢性乙肝引起的肝細(xì)胞癌。HBV屬于嗜肝DNA病毒科，基因組為部分雙鏈環(huán)狀DNA。HBV的核心顆粒直徑為28nm，為20面體，病毒衣殼由核心蛋白HBc組成。核衣殼的表面有包膜，包膜上含有三種大小的表面抗原preSl，preS2和HBsAg。有感染性的病毒顆粒又稱作Dane顆粒，直徑為42nm。HBV感染會導(dǎo)致一系列的肝臟疾病，從急性肝炎(包括暴發(fā)性肝功能衰竭)到慢性肝炎，肝硬化和肝細(xì)胞癌。HBV復(fù)制本身不直接導(dǎo)致細(xì)胞病變，多數(shù)的HBV攜帶者是無癥狀的，肝損害也很小，宿主的抗病毒免疫是導(dǎo)致肝損傷等臨床癥狀的主要原因。HBV感染人體后的癥狀與被感染者的年齡和免疫力相關(guān)。新生兒中肝炎99%以上是無癥狀的，1-5歲兒童中，只有10%是有癥狀的。三分之一的成人急性乙型肝炎患者有臨床癥狀，其中約1%為爆發(fā)性肝炎，致死率達(dá)到70%。爆發(fā)性肝炎伴隨著強(qiáng)烈的抗病毒免疫，病毒很快被清除。95%的成年人感染后會自發(fā)地清除病毒，而90%的幼兒和30%的1-5歲的兒童則會導(dǎo)致慢性感染。HBV感染和相關(guān)疾病的診斷是根據(jù)一系列的臨床的生化、組織和血清學(xué)的指標(biāo)來進(jìn)行的。檢測病毒感染的指標(biāo)主要有病毒的幾種抗原，和相對應(yīng)的特異性抗體以及HBV DNA ;檢測病人肝臟病變情況主要有血液丙氨酸和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase, ALT)，以及肝組織檢測炎癥和纖維化程度。
[0003]目前臨床上乙型肝炎病毒感染的治療主要有兩類藥物:干擾素和核苷類似物。臨床應(yīng)用的干擾素包括IFNa 2a、IFNa 2b和IFNa lb，這些是傳統(tǒng)的干擾素，還包括PEG-1FNa 2a和PEG-1FNa 2b。核苷類似物拉米夫定(Lamivudine, LAM)和替比夫定(telbivudine, LDT);脫氧鳥苷類似物恩替卡韋(Entecavir，ETV);核苷膦酸酯，阿德福韋酉旨(Adefovir, ADV)和富馬酸替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)。其中ETV, TDF和PEG-1FN最常用。IFN用于治療慢性HBV感染已經(jīng)有超過30年的歷史。臨床上IFN α對于HBeAg陽性的病人，在6個月內(nèi)，每周注射三次，有25%的病人HBeAg轉(zhuǎn)陰。12個月的IFNa治療結(jié)果顯示10-17%的病人HBsAg轉(zhuǎn)陰。對于HbeAb陰性的病人，12個月的IFN α治療后60%病人血清中檢驗不到HBV DNA。經(jīng)PEG修飾的IFN即PEG-1FN，其抗病毒機(jī)理與IFNa相同，但明顯提高了 IFNa的藥物代謝動力學(xué)，注射次數(shù)為每周一次，血清中IFNa濃度能維持較高的水平。2003年的一項研究表明，PEG-1FN的治療效果優(yōu)于IFN。但另一方面，PEG-1FN也有其副作用和局限，若治療初期的效果不佳，則應(yīng)停止用藥，考慮其他治療方案。核苷類似物通過抑制HBV RNA的逆轉(zhuǎn)錄來抑制HBV的復(fù)制。與IFN相比，核苷類似物有一些優(yōu)勢，如副作用小，方便等。但是也有一些缺點，如高復(fù)發(fā)率，低HBsAg轉(zhuǎn)陰率，單一用藥時容易產(chǎn)生耐藥性。
[0004]防御素(defensin)是一種抗微生物多妝，包括α-、β-、Θ-防御素，是宿主抵抗入侵病原體的天然免疫反應(yīng)的組成部分，能抵抗包括革蘭氏陽性細(xì)菌，革蘭氏陰性細(xì)菌，真菌，有包膜和無包膜的病毒在內(nèi)的各種微生物。人防御素-1 (Human0-defensin-l,hBDl)在多種器官的上皮細(xì)胞中組成性表達(dá)，有研究表明在克羅恩病中hBDl的組成性表達(dá)的缺失可能與PPARy的突變有關(guān)，在而在微生物感染和炎癥反應(yīng)中表達(dá)量增加，被認(rèn)為是上皮細(xì)胞中最重要的一種抗微生物多肽。hBDl的表達(dá)也受表觀遺傳性調(diào)控，HDACl調(diào)節(jié)hBDl的表達(dá)，抑制和siRNA沉默HDACl上調(diào)hBDl的表達(dá)。hBDl在睪丸上皮細(xì)胞，小腸上皮細(xì)胞，角膜，星形角質(zhì)細(xì)胞等上皮細(xì)胞中均高表達(dá)。hBDl在乳腺上皮細(xì)胞中高表達(dá)，在乳汁中的濃度可達(dá)到1-10 μ g/ml，提示hBDl在乳腺抗細(xì)菌和新生兒抵抗病原微生物中有重要作用。HBDl在肝細(xì)胞里也有較高的表達(dá)，有研究顯示，hBDl的表達(dá)量在HCC中下降，但是暫時沒有關(guān)于hBDl與HBV的相互關(guān)系的研究。對防御素家族成員的抗病毒作用的研究主要集中在α -防御素對HIV、HSV等的作用。HNP1-4的抗HIV作用主要包括，直接使病毒顆粒失活；與gpl20和CD4結(jié)合阻止病毒入侵；上調(diào)趨化因子MIP-1a和MIP-1 β ;抑制PKC的活性等。關(guān)于β-防御素-1對病毒的作用的研究只有其抗HIV活性，其具體機(jī)制尚不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是在于提供了一種人β -防御素-1在制備治療或預(yù)防乙型肝炎病毒感染藥物中的應(yīng)用，從而為臨床上乙型肝炎的治療提供一類安全高效且毒副作用小的多肽。通過單獨使用或者與其他抗HBV藥物聯(lián)合使用，人β-防御素-1能夠在預(yù)防或者治療乙型肝炎病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。
[0006]為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種人β -防御素-1在制備治療或預(yù)防乙型肝炎病毒感染藥物中的應(yīng)用，其步驟是: Α、人β -防御素-1抗乙型肝炎病毒活性的評價:
B、將人hBDl的過表達(dá)質(zhì)粒(本實驗室構(gòu)建)或小干擾RNA (廣州銳博公司合成)與能表達(dá)HBV的質(zhì)粒pHBVl.3 (D型，構(gòu)建方法見下文)共轉(zhuǎn)染到肝細(xì)胞系IfepG2 (來自ATCC)或Huh7 (來自ATCC)中，隨后檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV分泌抗原HBeAg和HBsAg (上?？迫A)的表達(dá)量和細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體核衣殼相關(guān)DNA的水平。
[0007]本實驗結(jié)果如圖1所示。過表達(dá)和干擾實驗都證明，hBDl能下調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV分泌抗原HBeAg和HBs的表達(dá)量和細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體核衣殼相關(guān)DNA的水平，說明hBDl抑制HBV復(fù)制，具有抗乙型肝炎病毒的活性。
[0008]所述的hBDl的過表達(dá)質(zhì)粒，其構(gòu)建過程見實施例1。
[0009]所述的質(zhì)粒pHBVl.3，其構(gòu)建過程是，提取H印G2.2.15細(xì)胞(來自ATCCM^ DNA，擴(kuò)增 HBV DNA 并插入載體 pBluescript II (購自 Invitrogen)。
[0010]所述的抗乙型肝炎藥物是以人β -防御素-1作為藥物活性成分，利用常規(guī)技術(shù)可制成片劑、膠囊、顆粒劑、口服液、緩釋制劑、控釋制劑、納米制劑(活性成分含量5%(質(zhì)量比，以下相同)，其余為相應(yīng)輔料(90%淀粉和5% PVP))或注射劑(規(guī)格為lmg/mL，溶于生理鹽水)任何一種藥學(xué)上接受的劑型。
[0011]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果:
1.人β-防御素-1是在人體內(nèi)組成性表達(dá)的一種抗微生物多肽，生理濃度下對人體沒有毒副作用。
[0012]2.防御素的抗病毒作用機(jī)制是通過直接作用于病毒包膜，或影響病毒吸附，或改變細(xì)胞內(nèi)的信號通路，從而抗病毒，因其抗病毒的機(jī)制多樣化，不易使病毒產(chǎn)生耐藥性。