一種真皮組織仿生海綿的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)用仿生材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種以絲蛋白與膠原蛋白為原料 制備真皮組織仿生海綿的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 燒傷、創(chuàng)傷、手術(shù)切口等外傷所造成的皮膚缺損是臨床常見病和多發(fā)病，在皮膚缺 損修復過程中，傷口過度愈合會導致病理性瘢痕的發(fā)生和發(fā)展。病理性瘢痕包括增生性瘢 痕和瘢痕疙瘩，會造成瘙癢、毀容、殘疾等一系列嚴重的并發(fā)癥，有時甚至誘發(fā)惡性腫瘤，嚴 重影響患者的生存質(zhì)量。因此，病理性瘢痕的防治一直是燒傷、整形等外科學領(lǐng)域中亟待解 決的難題。
[0003] 近年來，隨著創(chuàng)面愈合機制研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)，瘢痕形成與真皮組織缺失 程度具有高度相關(guān)性，這一理論在臨床實踐中也得到了佐證，如淺度燒傷創(chuàng)面在愈合后與 正常皮膚類似，而深度燒傷創(chuàng)面在愈合后將形成病理性瘢痕。這一理論提示：真皮組織的存 在能夠抑制瘢痕發(fā)生和發(fā)展。因此，發(fā)揮真皮組織作用的真皮仿生材料被臨床用于促進深 度皮膚缺損創(chuàng)面的愈合并抑制瘢痕形成，并取得了一定的效果。
[0004] 目前，已上市真皮仿生產(chǎn)品可分為兩類：脫細胞真皮基質(zhì)和體外合成高分子支 架。脫細胞真皮基質(zhì)是由人尸體皮、豬皮、豬小腸粘膜下層經(jīng)脫細胞處理得到的成分異質(zhì) 的高分子支架材料，其主要成分為膠原蛋白。體外合成高分子支架是由合成高分子（如 polyglactin)或動物源天然高分子（如膠原蛋白和/或糖胺聚糖）等體外合成的高分子支 架。
[0005] 雖然已有真皮仿生材料在促進創(chuàng)面修復和抑制瘢痕形成兩方面發(fā)揮了有效作用， 但在臨床應(yīng)用過程中仍然存在不足之處。首先，由于加工工藝難以控制，脫細胞真皮基質(zhì)類 真皮仿生材料的質(zhì)量不穩(wěn)定，各生產(chǎn)批次之間往往存在質(zhì)量差別，這將其作為真皮替代物 修復創(chuàng)面的應(yīng)用效果，并可能造成二次手術(shù)等嚴重后果。其次，脫細胞真皮基質(zhì)真皮仿生 材料存在生物污染的可能性，由于原料人尸體皮可能攜帶病毒，并且這些病毒在材料加工 過程中未被有效清除，而導致病毒傳播。再次，體外合成真皮仿生材料在創(chuàng)面的降解速度與 組織生成的速度不匹配，往往因降解過快而導致其促進傷口修復和抑制瘢痕形成的作用減 弱。另外，現(xiàn)有真皮仿生材料在抑制瘢痕形成方面的作用效果遠未達到促進功能性類真皮 組織再生的目標。究其原因，真皮仿生材料在加工過程中結(jié)構(gòu)被破壞和體外合成真皮仿生 材料未實現(xiàn)對真皮組織的仿生是影響其再生的重要因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供一種真皮組織仿生海綿的制備方法。 本發(fā)明真皮組織仿生海綿具有在微結(jié)構(gòu)、力學性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)方面對真皮組織的仿生性 能，有利于提高其抑制瘢痕形成和促進功能性真皮組織再生的性能，從而為解決病理性瘢 痕的難題提供新方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] -種真皮組織仿生海綿的制備方法，所述真皮組織仿生海綿所含原料的質(zhì)量百分 數(shù)為：絲蛋白10%~95%，膠原蛋白5%~90% ;具體制備步驟為：
[0009] (1)將蠶繭置于Na2CO3水溶液中沸煮30min，然后用去離子水潤洗3次，制得蠶絲 素纖維；然后將蠶絲素纖維置于溴化鋰溶液中，37°C條件下溶解，制得絲蛋白溴化鋰溶液； 最后將所得溶液在截留分子量為3500Da的透析盒中透析3天后，得絲蛋白溶液，調(diào)節(jié)溶液 質(zhì)量百分濃度為5% ;
[0010] (2)將步驟⑴制得的絲蛋白溶液與質(zhì)量百分濃度為1. 5%的膠原蛋白溶液在 37°C條件下按體積比0. 4~57:10混合，在速度為50rpm/min的漩禍振蕩器上振蕩5min，至 混合均勻，然后在離心力為1500g下離心3min，除去溶液中的氣泡；
[0011] (3)將步驟（2)離心后的混合液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度為2mm，然后 將此槽放置于37°C、吸風風速為0. 3米/秒的通風櫥中央，放置時間為24h，形成絲蛋白/ 膠原蛋白高分子膜；
[0012] (4)將絲蛋白/膠原蛋白高分子膜浸沒于1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺 和N-羥基琥珀酰亞胺混合水溶液中，40°C下放置8h ;將所得高分子膜在300ml去離子水中 浸泡30min，此步驟重復3次，最后將所得高分子膜在300ml液氮溶液中冷凍IOmin ;
[0013] (5)將冷凍的高分子膜在真空冷凍干燥機中冷凍干燥，真空冷凍干燥條件為：冷 阱溫度_55°C、真空度3~5Pa，時間18h，制得絲蛋白/膠原蛋白復合材料，即所述真皮組織 仿生海綿。
[0014] 步驟⑴中所述Na2CO3水溶液濃度為0. 01~IM ;所述溴化鋰溶液的濃度為1~ 20M〇
[0015] 步驟（4)中所述1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺混 合水溶液中1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的濃度比為1:1， 均為0. 02M ;所述混合溶液的pH值為4. 5。
[0016] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0017] (1)本發(fā)明以蠶繭來源的天然高分子絲蛋白作為構(gòu)建真皮仿生海綿的主要原料、 膠原蛋白作為次要原料，通過水蒸氣蒸發(fā)法使海綿中的絲蛋白分子發(fā)生物理交聯(lián)，改善了 海綿的微結(jié)構(gòu)，增強了材料的多孔性能；通過此制備方法，絲蛋白基海綿的硬度降低，接近 正常皮膚的彈性；引入膠原蛋白并并與絲蛋白形成互穿網(wǎng)絡(luò)，能夠促進海綿對真皮組織中 細胞的黏附性和增殖活性，并降低海綿的生物降解速度。絲蛋白是所制備真皮組織仿生海 綿的主要基質(zhì)，膠原蛋白次要基質(zhì)和對絲蛋白自組裝過程具有調(diào)控作用的物質(zhì)。
[0018] (2)本發(fā)明所用絲蛋白分子能夠發(fā)生物理交聯(lián)，避免了在構(gòu)建真皮替代物的過程 中引入有毒的化學交聯(lián)劑，提高海綿的生物相容性；絲蛋白分子結(jié)構(gòu)中約含有85%的甘氨 酸、丙氨酸和絲氨酸的重復嵌段，這些重復嵌段之間會形成氫鍵而使絲蛋白分子內(nèi)部或絲 蛋白分子之間產(chǎn)生疏水結(jié)構(gòu)，這種疏水結(jié)構(gòu)使絲蛋白分子發(fā)生物理交聯(lián)，而避免使用化學 交聯(lián)劑。
[0019] (3)本發(fā)明通過水蒸氣蒸發(fā)使絲蛋白分子發(fā)生物理交聯(lián)，能夠促進海綿對真皮組 織結(jié)構(gòu)和力學性能的仿生性能，水蒸氣蒸發(fā)過程能夠促進絲蛋白分子自組裝形成Silk I結(jié) 構(gòu)并抑制Silk II結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，而在甲醇水溶液中絲蛋白分子發(fā)生自組裝主要形成Silk II 的機構(gòu)。當絲蛋白分子的物理交聯(lián)形式主要為Silk I時，所獲得的絲蛋白基海綿材料在 孔結(jié)構(gòu)和力學性能方面優(yōu)于Silk II結(jié)構(gòu)為主的絲蛋白材料，從而降低了所制備的絲蛋白 /膠原蛋白海綿硬度，使其在力學性質(zhì)方面與真皮組織更加接近，具有抑制瘢痕形成和促進 真皮組織再生的功能。（4)本發(fā)明膠原蛋白分子的引入能夠提高真皮成纖維細胞和微血管 內(nèi)皮細胞在絲蛋白/膠原蛋白海綿中的黏附和增殖活性，膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)中含有細胞黏 附所需的氨基酸序列，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)，這一序列在細胞表面的受體為整 合蛋白，RGD與整合蛋白的結(jié)合會激活促進細胞增殖的信號通路，從而加速細胞增殖。
[0020] (5)本發(fā)明采用1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺濃度和N-羥基琥珀酰亞 胺對絲蛋白/膠原蛋白膜進行交聯(lián)處理，能夠?qū)⒛z原蛋白分子固定于絲蛋白交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中， 形成完全互穿網(wǎng)絡(luò)，有利于延長絲蛋白/膠原蛋白海綿在體內(nèi)的降解周期，作為真皮替代 物更長時間地參與創(chuàng)面愈合，發(fā)揮更強地抑制瘢痕形成和促進真皮組織再生的功能。
[0021] (6)本發(fā)明采用真空冷凍干燥處理獲得絲蛋白/膠原蛋白基海綿，能夠材料在干 態(tài)下保持其多孔結(jié)構(gòu)和力學特性。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明實施例1制得的真皮組織仿生海綿的掃描電鏡圖。
[0023] 圖2為本發(fā)明對比例1制得的純絲蛋白膜的掃描電鏡圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明進行具體描述。
[0025] 實施例1
[0026] (1)將IOg蠶繭置于500ml的0? 02M Na2CO3水溶液中沸煮30min，然后用去離子水 潤洗3次，制得蠶絲素纖維；然后將蠶絲素纖維置于IOml 9. 3M的溴化鋰溶液中，37°C條件 下溶解，制得絲蛋白溴化鋰溶液；最后將所得溶液在截留分子量為3500Da的透析盒中透析 3天后，得絲蛋白水溶液，調(diào)節(jié)溶液質(zhì)量百分濃度為5% ;
[0027] (2)將步驟⑴制得的絲蛋白溶液與質(zhì)量百分濃度為1.5%的膠原蛋白溶液在 37°C條件下按體積比7:10混合，在速度為50rpm/min的漩禍振蕩器上振蕩5min，至混合均 勻，然后在離心力為1500g下離心3min，除去溶液中的氣泡；
[0028] (3)將步驟⑵離心后的混合液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度為2mm，然后 將此槽放置于37°C、吸風風速為0. 3米/秒的通風櫥中央，放置時間為24h，形成絲蛋白/ 膠原蛋白高分子膜；
[0029] (4)將絲蛋白/膠原蛋白高分子膜浸沒于300ml 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳 二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺混合水溶液中（溶質(zhì)1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺 濃度為〇. 02M，溶質(zhì)N-羥基琥珀酰亞胺濃度為0. 02M，pH = 4. 5)，40°C下放置8h ;將所得高 分子膜在300ml去離子水中浸泡30min，此步驟重復3次，最后將所得高分子膜在300ml液 氮溶液中冷凍IOmin ;
[0030] (5)將冷凍的高分子膜在真空冷凍干燥機中冷凍干燥，真空冷凍干燥條件為：冷 阱溫度_55°C、真空度5Pa，時間18h，制得絲蛋白/膠原蛋白復合材料，即所述真皮組織仿生 海綿。其中，絲蛋白的質(zhì)量分數(shù)為70 %，膠原蛋白的質(zhì)量分數(shù)為30 %。
[0031] 通過掃描電子顯微鏡觀察實施例1所述真皮組織仿生海綿的微觀結(jié)構(gòu)，如圖1所 示。由圖1可以看出，由水蒸氣蒸發(fā)處理所得的真皮組織仿生海綿，其內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)為聯(lián)通 的多孔結(jié)構(gòu)。
[0032] 實施例2
[0033] (1)將IOg蠶繭置于500ml的IM Na2CO3水溶液中沸煮30min，然后用去離子水潤 洗3次，制得蠶絲素纖維；然后將蠶絲素纖維置于IOml IOM的溴化鋰溶液中，37°C條件下溶 解，制得絲蛋白溴化鋰溶液；最后將所得溶液在截留分子量為3500Da的透析盒中透析3天 后，得絲蛋白水溶液，調(diào)節(jié)溶液質(zhì)量百分濃度為5% ;