一種抗菌抗炎的天然生物材料及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物材料領域，具體涉及一種具抗菌抗炎的天然生物材料及其應用。
【背景技術】
[0002]組織再生修復是現代醫(yī)學的重要研究課題。人體組織的基本結構由細胞和細胞外基質所構成，細胞和細胞外基質的相互作用是創(chuàng)傷組織再生修復的關鍵。為缺損組織提供細胞外基質，能促進周圍健康的細胞進入缺損組織發(fā)揮修復作用。但人體的細胞外基質受來源、倫理等的限制，使用受限。
[0003]小腸黏膜下層細胞外基質(small intestinal submucosa, SIS)作為一種天然細胞外基質材料，與人體的細胞外基質組成和結構接近，且經過脫細胞處理后免疫原性極低。但PSIS仍存在以下不足，天然的PSIS為薄膜狀材料，用于皮膚等組織的修復缺乏足夠的厚度，其次，需要在其表面接種細胞時，過程較為繁瑣，使用不便。
[0004]利用SIS的主要成分膠原蛋白制備水凝膠或膠原海綿，用作細胞及藥物的緩釋載體及3D培養(yǎng)細胞支架已有報道，以改進天然生物材料在使用上的便利性。但上述水凝膠仍存在不足:一是其成分僅有膠原蛋白組成，結構成分與天然細胞外基質組成存在差異，其次水凝膠物理質脆易碎，操作不便，限制了它在體表創(chuàng)面修復上的臨床應用。
[0005]另外，在體表創(chuàng)面的修復中，易受細菌污染，通常創(chuàng)面部位的炎癥反應較重，因此，為更好的促進創(chuàng)面修復，需要在現有的SIS基礎上，對其進行進一步的改進，使其在原有促進創(chuàng)面修復的功能基礎上，增加抗菌，抗炎的功能，同時方便使用。使用納米銀進行抗菌是目前常用的一種抗菌方法，但大多采用物理吸附法，其缺點是遇水后迅速釋放，長效抗菌效果差。此外，同時具備抗菌、抗炎功能的天然生物材料目前尚未見報道，因此本發(fā)明的目的是解決上述問題，為體表創(chuàng)面修復提供一種抗菌抗炎，同時能促進組織再生修復的天然生物材料。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種由SIS為原料做成的海綿狀生物材料，其主要成分結構與人體天然細胞外基質成分接近，同時具備抗炎，抗菌功能，無細胞毒性，生物相容性好，能促進慢性創(chuàng)面的修復，如皮膚等。
[0007]本發(fā)明的目的是通過以下措施實現的:
[0008]一種生物材料，由小腸黏膜下層細胞外基質(small intestinal submucosa, SIS)制成，其特征在于:所述生物材料含有納米銀，所述材料為多孔結構，孔隙相互貫通，體積壓縮85%以上可恢復原有形態(tài)。優(yōu)選為90%以上。本發(fā)明具備抗炎，抗菌功能，無細胞毒性，生物相容性好。
[0009]上述生物材料為多孔結構，孔隙相互貫通，體積壓縮85%以上可恢復原有形態(tài)。
[0010]優(yōu)選地，上述體積壓縮和恢復原有形態(tài)可以在液體中進行。其具有良好的形態(tài)記憶功能，可利用其有水的環(huán)境里受壓后可立即恢復原有形態(tài)，可以通過擠壓排水后快速吸附細胞懸液恢復形態(tài)，將細胞轉移至材料內部，通過體外孵育4h左右即可使細胞充分粘附在支架上，構建細胞緩釋載體。不需要體外培養(yǎng)數天，讓細胞迀移爬行至材料內部。大大減少了移植準備時間。且其相互連通的多孔結構還為營養(yǎng)物質的交換及血管內皮細胞的迀移提供良好的條件。
[0011]優(yōu)選地，上述生物材料平均孔徑為70-150 μ mo
[0012]上述納米銀由維生素C還原而成。本發(fā)明中納米銀與SIS材料結合緊密，緩釋時間長，抗菌效果更為持久，同時還增強了抗菌抗炎作用。
[0013]上述生物材料，原料包括豬小腸黏膜下層細胞外基質(Pig small intestinalsubmucosa，PSIS)和硝酸銀。PSIS:硝酸銀的質量比為8-12: 6: 10。優(yōu)選地，SIS粉末:硝酸銀的質量比為10: 8.5。
[0014]上述生物材料，以1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)為交聯劑。本發(fā)明在交聯完成后并不會接枝到材料上，通過漂洗即可同MES、NHS 一起從材料內部清除，而現有冷凝膠均需通過添加額外有毒化學基團(甲基丙烯酰胺、己二酸二酰肼等)達到交聯效果，且操作步驟繁瑣。優(yōu)選地，豬小腸黏膜下層細胞外基質粉碎后配制的溶液:EDC溶液的體積比為5-10: 1-3。EDC濃度為5-30mM，SIS粉末溶液濃度8-10mg/ml。優(yōu)選為8: I。
[0015]上述生物材料，其制備方法包括以下步驟:配制PH值為5.5的MES (0.1M)緩沖液，在其中溶解0.1 % VitC ;將SIS粉末按終濃度為10mg/ml的量溶于MES-VitC溶液中，4°C下攪拌過夜至完全溶解；1000轉/分離心2分鐘；將SIS溶液與50mM硝酸銀溶液混合均勻，溶液體積比為SIS:硝酸銀=7: 1，溶液變黑，靜止30分鐘；取EDC/NHS交聯液混合均勻，溶液含銀SIS溶液:EDC: NHS的體積比為8: I: I ;_80°C交聯24h形成海綿；_40°C冷干。
[0016]上述生物材料，其制備方法包括以下步驟:
[0017](I)PSIS粉末的制備
[0018]獲取新鮮豬小腸，首先通過機械方法將小腸的漿膜層和肌層去除，生理鹽水反復沖洗干凈；用甲醇和氯仿(I: 1，V/V)脫脂溶液浸泡12小時，并用去離子水以除去有機溶劑；隨后，將SIS浸泡在0.05%胰蛋白酶/0.05%乙二胺四乙酸溶液中，室溫下消化12小時，生理鹽水溶液反復洗滌去除胰蛋白酶；將SIS置于0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)生理鹽水中搖晃振蕩4小時，并用生理鹽水溶液徹底沖洗以除去洗滌劑；將處理后的SIS浸于0.5%醋酸溶液中過夜，粉碎，加胃蛋白酶4°C酶解2天后過濾；濾液經兩次鹽析離心后取沉淀；將沉淀溶于0.1%醋酸中，透析去除NaCl，并用冷凍干燥機在-40°C條件下冷凍干燥48小時，將凍干的SIS海綿進一步粉碎后得到SIS粉末；
[0019](2)抗菌抗炎的PSIS海綿制備
[0020]配制PH值為5.5的MES (0.1M)緩沖液，在其中溶解0.1 % VitC ;將SIS粉末按終濃度為10mg/ml的量溶于MES-VitC溶液中，4°C下攪拌過夜至完全溶解；1000轉/分離心2分鐘；將SIS溶液與50mM硝酸銀溶液混合均勻，溶液體積比為SIS:硝酸銀=7: 1，溶液變黑，靜止30分鐘；取EDC/NHS交聯液混合均勻，溶液含銀SIS溶液:EDC: NHS的體積比為8:1:1 ;-80°C交聯24h形成海綿；-40°C冷干。
[0021]上述生物材料在創(chuàng)面修復中的應用。具有抗菌功能，含有Vc，具有抗氧化功能，能促進創(chuàng)面的愈合。
[0022]本發(fā)明所述生物材料為PSIS海綿材料。
[0023]有益效果
[0024]1.本發(fā)明采用脫細胞PSIS粉末，利用水溶性碳化二亞胺零長交聯，在不添加任何化學基團的條件下實現了 PSIS海綿的制備；并賦予其多孔并且相互貫通的特性，具有彈性形變能力及形態(tài)記憶功能，改善其機械性能，減緩降解率，使其能更好的促進細胞的粘附與生長。
[0025]2.本發(fā)明經實驗驗證支架材料的孔隙大小、體內外降解率、生物相容性及細胞毒性、體外細胞培養(yǎng)及動物移植實驗證明本發(fā)明制得的SIS海綿支架的具有良好生物性能。
[0026]3.本發(fā)明的PSIS海綿具有彈性形變能力，可隨意鉗夾、擠壓而不破碎。較水凝膠具有明顯的優(yōu)勢。且因為其具有形態(tài)記憶功能，在有水的環(huán)境里受壓后可立即恢復原有形態(tài)，可利用其特性通過擠壓排水后快速吸附細胞懸液恢復形態(tài)，將細胞轉移至材料內部，通過體外孵育4h使細胞充分粘附在支架上，構建細胞緩釋載體。不需要體外培養(yǎng)數天，讓細胞迀移爬行至材料內部。大大減少了移植準備時間。其相互連通的多孔結構還為營養(yǎng)物質的交換及血管內皮細胞的迀移提供良好的條件。
[0027]4.本發(fā)明海綿的降解速率及機械性能均得到明顯改善。
[0028]5.本發(fā)明中，小腸黏膜下層細胞外基質主要成分為I型和III型膠原，含有豐富的羧基和氨基，通過H)C將氨基和羧基鏈接。室溫溶解后形成大小不一的孔徑，已完成交聯的小腸粘膜下層細胞外基質具有一定的機械強度，可維持海綿的形態(tài)。當遇到外力時通過改變孔徑大小實現彈性形變，去除外力后吸水恢復。
[0029]6.