一種真皮組織仿生多孔支架的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)用仿生材料技術領域，尤其是涉及一種以絲蛋白和海藻酸為原料， 制備真皮組織仿生多孔支架的方法。
【背景技術】
[0002] 燒創(chuàng)傷等開放性傷口所造成的皮膚缺損是臨床常見病和多發(fā)病，在皮膚缺損修復 過程中，傷口過度愈合會導致病理性瘢痕的發(fā)生和發(fā)展。病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢 痕疙瘩，會導致瘙癢、毀容、殘疾等一系列嚴重的并發(fā)癥，有時甚至誘發(fā)惡性腫瘤，嚴重降低 患者的生存質量。因此，病理性瘢痕的防治一直是燒傷、整形等外科學領域中亟待解決的醫(yī) 學問題。
[0003] 近年來，隨著創(chuàng)面愈合機制研究的不斷深入，人們認識到，瘢痕形成與真皮組織缺 失程度具有高度相關性，這一理論在臨床實踐中得到了佐證，如淺度燒傷創(chuàng)面在愈合后新 生組織與正常皮膚類似，而深度燒傷創(chuàng)面在愈合后將形成病理性瘢痕。這一理論提示：真皮 組織的存在能夠抑制瘢痕形成。因此，發(fā)揮真皮組織作用的真皮替代物已被臨床用于促進 深度皮膚缺損創(chuàng)面的愈合和抑制瘢痕形成。然而，現(xiàn)有真皮替代物仍然未達到抑制病理性 瘢痕發(fā)生和發(fā)展的目標。目前，已上市真皮替代物產(chǎn)品可分為兩類：脫細胞真皮基質和體外 合成高分子支架。脫細胞真皮基質是由人尸體皮、豬皮、豬小腸粘膜下層經(jīng)脫細胞處理所得 到的成分異質的高分子支架材料，其主要成分為膠原蛋白。體外合成高分子支架是由合成 高分子（如polyglactin)或動物源天然高分子（如膠原蛋白和/或糖胺聚糖）等體外合 成的高分子支架。
[0004] 已有仿真皮材料在促進創(chuàng)面修復和抑制瘢痕形成兩方面發(fā)揮了有效作用，但在臨 床應用過程中仍然存在不足之處。首先，由于加工工藝難以控制，脫細胞真皮基質類仿生真 皮的質量不穩(wěn)定，各生產(chǎn)批次之間往往存在質量差別，這將影響其作為真皮替代物修復創(chuàng) 面的應用效果，并可能造成二次手術等嚴重后果。其次，脫細胞真皮基質仿生真皮存在生物 污染的可能性，由于原料人尸體皮可能攜帶病毒，并且這些病毒在材料加工過程中未被有 效清除，而導致病毒傳播。再次，體外合成仿生真皮在創(chuàng)面的降解速度與組織生成的速度不 匹配，往往因降解過快而導致其促進傷口修復和抑制瘢痕形成的作用減弱。另外，現(xiàn)有仿生 真皮在抑制瘢痕形成方面的作用效果遠未達到促進功能性類真皮組織再生的目標。究其原 因，仿生真皮在加工過程中結構被破壞和體外合成仿生真皮未實現(xiàn)對真皮組織的仿生是影 響仿真皮材料促進真皮組織再生的重要因素。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術存在的上述問題，本發(fā)明提供一種真皮組織仿生多孔支架的制備方 法。本發(fā)明真皮組織仿生多孔支架材料可有效促進創(chuàng)面修復和抑制瘢痕形成，燒創(chuàng)傷等開 放性傷口有很好的治療效果。
[0006] 本發(fā)明的技術方案如下：
[0007] -種真皮組織仿生多孔支架的制備方法，所述真皮組織仿生多空支架所含原料的 質量百分數(shù)為：絲蛋白50%~90%，海藻酸10%~50% ;具體制備步驟為：
[0008] (1)將蠶繭置于Na2C03水溶液中沸煮30min，然后用去離子水潤洗3次，制得蠶絲 素纖維；然后將蠶絲素纖維置于溴化鋰溶液中，37°C條件下溶解，制得絲蛋白溴化鋰溶液； 最后將所得溶液在截留分子量為3500Da的透析盒中透析3天后，得絲蛋白溶液，調節(jié)溶液 質量百分濃度為5% ;
[0009] (2)將步驟（1)制得的絲蛋白溶液與質量百分濃度為2%的海藻酸溶液在37°C條 件下按體積比4~36:10混合，在速度為50rpm/min的漩禍振蕩器上振蕩5min，至混合均 勻，然后在離心力為1500g下離心3min，除去溶液中的氣泡；
[0010] (3)將步驟（2)離心后的混合液轉移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度為2mm，然后 將此槽放置于37°C、吸風風速為0. 3米/秒的通風櫥中央，放置時間為24h，形成絲蛋白/ 海藻酸高分子膜；
[0011] (4)將絲蛋白/海藻酸高分子膜浸沒于濃度為0. 002M的氯化鈣水溶液中，37°C下 孵育2h，然后將所得高分子膜在300ml去離子水中浸泡30min，重復三次最后將高分子膜在 300ml液氮溶液中冷凍lOmin ;
[0012] (5)將冷凍的高分子膜在真空冷凍干燥機中冷凍干燥，真空冷凍干燥條件為：冷 阱溫度_55°C、真空度3~5Pa，時間18h，制得絲蛋白/海藻酸復合材料，即所述真皮組織仿 生多孔支架。
[0013] 步驟⑴中所述Na2C03水溶液濃度為0. 01~1M ;所述溴化鋰溶液的濃度為1~ 20M〇
[0014] 本發(fā)明有益的技術效果在于：
[0015] (1)本發(fā)明絲蛋白分子能夠發(fā)生物理交聯(lián)，避免了在構建仿生真皮組織的過程中 引入有毒的化學交聯(lián)劑，提高材料的生物相容性，絲蛋白分子結構中約含有85%的甘氨酸、 丙氨酸和絲氨酸的重復嵌段，這些重復嵌段之間會形成氫鍵而使絲蛋白分子內部或絲蛋白 分子之間產(chǎn)生疏水結構，這種疏水結構使絲蛋白分子發(fā)生物理交聯(lián)，而避免使用化學交聯(lián) 劑。
[0016] (2)本發(fā)明通過水蒸氣蒸發(fā)使絲蛋白分子發(fā)生物理交聯(lián)的方法，能夠促進絲蛋白 基支架材料對真皮組織結構和力學性能的仿生性能，降低了所制備的絲蛋白/海藻酸多孔 支架的硬度，有利于仿生真皮組織抑制瘢痕形成和促進真皮組織再生的功能，這是由于水 蒸氣蒸發(fā)過程能夠促進絲蛋白分子自組裝形成Silk I結構并抑制Silk II結構的產(chǎn)生，而 在甲醇水溶液中絲蛋白分子發(fā)生自組裝主要形成Silk II結構，即0-sheet結構。當絲蛋 白分子的物理交聯(lián)形式主要為Silk I時，絲蛋白基支架材料在孔結構和力學性能方面優(yōu)于 以Silk II結構為主的相應材料，使其在力學性質方面與真皮組織更加接近。
[0017] (3)本發(fā)明海藻酸分子的引入能夠提高真皮成纖維細胞和微血管內皮細胞在絲蛋 白/海藻酸多孔支架中的黏附和增殖活性；對絲蛋白自組裝過程具有調控作用；糖胺聚糖 通過與細胞外基質中的細胞因子、生長因子等發(fā)生相互作用，提高這些蛋白質信號分子的 生物利用度，從而提高細胞的生物活性；海藻酸的分子結構與脫細胞真皮基質中的糖胺聚 糖結構類似，能夠發(fā)揮與糖胺聚糖類似的生物學作用，因而，在絲蛋白支架中引入海藻酸能 夠促進真皮成纖維細胞和微血管內皮細胞的黏附性和增殖活性。
[0018] (4)本發(fā)明采用鈣離子對絲蛋白/海藻酸多孔支架進行交聯(lián)處理，此化學交聯(lián)法 能夠將海藻酸分子固定于絲蛋白交聯(lián)網(wǎng)絡中，形成互穿網(wǎng)絡，從而阻礙酶在支架網(wǎng)絡中的 擴散和活性，減慢絲蛋白/海藻酸的生物降解速度。
[0019] (5)本發(fā)明采用真空冷凍干燥處理獲得絲蛋白/海藻酸多孔支架，能夠材料在干 態(tài)下保持其多孔結構和力學特性。
[0020] (6)本發(fā)明通過水蒸氣蒸發(fā)法使多孔支架中的絲蛋白分子發(fā)生物理交聯(lián)，改善了 絲蛋白基多孔支架材料的微結構，增強了材料的多孔性能；并且，通過此制備方法，絲蛋白 基支架材料的硬度降低，接近正常皮膚的彈性；本發(fā)明所涉及的多孔支架為完全互穿網(wǎng)絡 結構，離子交聯(lián)的海藻酸網(wǎng)絡能夠提高材料的生物相容性，促進真皮組織所含細胞對支架 的黏附性和在支架中的增殖活性；海藻酸是細胞外基質所含糖胺聚糖的擬似物，糖胺聚糖 有利于提尚細胞的活性。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實施例1所得真皮組織仿生多孔支架的掃描電鏡圖。
[0022] 圖2為本發(fā)明對比例1所得純絲蛋白膜的掃描電鏡圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合附圖和實施例，對本發(fā)明進行具體描述。
[0024] 實施例1
[0025] -種真皮組織仿生多孔支架的制備方法，具體制備步驟為：
[0026] (1)將10g蠶繭置于500ml的0? 02M Na2C03水溶液中沸煮30min，然后用去離子水 潤洗3次，制得蠶絲素纖維；然后將蠶絲素纖維置于10ml的10M溴化鋰溶液中，37°C條件下 溶解，制得絲蛋白溴化鋰溶液；最后將所得溶液在截留分子量為3500Da的透析盒中透析3 天后，得絲蛋白溶液，調節(jié)溶液質量百分濃度為5% ;
[0027] (2)將步驟⑴制得的絲蛋白溶液與質量百分濃度為2%的海藻酸溶液在37°C條 件下按體積比10:10混合，在速度為50rpm/min的漩禍振蕩器上振蕩5min，至混合均勾，然 后在離心力為1500g下離心3min，除去溶液中的氣泡；
[0028] (3)將步驟⑵離心后的混合液轉移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度為2mm，然后 將此槽放置于37°C、吸風風速為0. 3米/秒的通風櫥中央，放置時間為24h，形成絲蛋白/ 海藻酸高分子膜；
[0029] (4)將絲蛋白/海藻酸高分子膜浸沒于濃度為0. 002M的氯化鈣水溶液中，37°C下 孵育2h，然后將所得高分子膜在300ml去離子水中浸泡30min，重復三次最后將高分子膜在 300ml液氮溶液中冷凍lOmin;
[0030] (5)將冷凍的高分子膜在真空冷凍干燥機中冷凍干燥，真空冷凍干燥條件為：冷 阱溫度_55°C、真空度3~5Pa，時間18h，制得絲蛋白/海藻酸復合材料，即所述真皮組織仿 生多孔支架。其中，絲蛋白的質量百分含量為72 %，海藻酸的質量百分含量為28 %。
[0031] 通過掃描電子顯微鏡觀察實施例1所述的真皮組織仿生多孔支架的微觀結構，如 圖1所示。由圖1可以看出，由水蒸氣蒸發(fā)處理所得的真皮組織仿生多孔支架，其內部微觀 結構為聯(lián)通的多孔結構。
[0032] 實施例2
[0033] -種真皮組織仿生多孔支架的制備方法，具體制備步驟為：
[0034] (1)將10g蠶繭置于500ml的0? 05M Na2C03水溶液中沸煮30min，然后用去離子水