一種組合物、制劑及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞領(lǐng)域，特別涉及一種組合物、制劑及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 從生物學上講，衰老是生物隨著時間的推移，自發(fā)的必然過程，它是復雜的自然現(xiàn) 象，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)的退行性變和機能的衰退，適應性和抵抗力減退。在生理學上，把衰老看作 是從受精卵開始一直進行到老年的個體發(fā)育史。從病理學上，衰老是應激和勞損，損傷和感 染，免疫反應衰退，營養(yǎng)失調(diào)，代謝障礙以及疏忽和濫用藥物積累的結(jié)果。
[0003] 美容和抗衰老越來越成為人們對美麗追求的手段，相應的也出現(xiàn)了越來越多的美 容抗衰老產(chǎn)品，在這些產(chǎn)品中，以外用的護膚產(chǎn)品為主，起到延緩衰老和皮膚保持彈性的目 的，但這些產(chǎn)品無法滿足有面孔缺損等方面問題的人群對美容抗衰老的需求。而本專利的 產(chǎn)品能很好的解決這些面孔缺損問題，起到面部缺損修復和面部年輕化的目的。
[0004]目前常采用高濃度血漿濃縮（PRP)進行面部缺損修復，是利用自身血液制作的富 含血小板的高濃度血漿。但是PRP制劑無細胞成分，主要是血小板，通過血小板分泌各類生 長因子促進周圍組織細胞的增殖來達到組織修復的功能，缺損修復能力低，時間長。血小板 缺陷、纖維蛋白合成障礙、血流動力不穩(wěn)定等人群不能使用。PRP制劑需要從自體抽取外周 血進行血小板濃縮，屬于血液制品，不適用于不具備醫(yī)療資質(zhì)的機構(gòu)單位。
[0005] 因此，提供一種快速高效修改面孔缺損的干細胞制劑均有重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種組合物、制劑及其用途。該制劑充分利用干細胞的增殖 分化能力、玻尿酸和透明質(zhì)酸鈉的保濕以及EGF的促進細胞生長作用，達到穩(wěn)定高效的修 復面孔缺損問題。
[0007] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種組合物，包括臍帶間充質(zhì)干細胞、生長因子、透明質(zhì)酸或其鹽。
[0009] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，組合物還包括玻尿酸。
[0010] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，以mg/mL計，所述生長因子在所述組合物中的 質(zhì)量體積比為1. 5~2. 5:1。
[0011] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，以cell/mL計，所述臍帶間充質(zhì)干細胞在所述 組合物中的密度為5 X105。
[0012] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述透明質(zhì)酸鹽為透明質(zhì)酸鈉，所述透明質(zhì)酸 鈉在所述組合物的中質(zhì)量百分含量為5%~10%。
[0013] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述透明質(zhì)酸或所述玻尿酸在所述組合物的中 質(zhì)量百分含量為10 %~20%。
[0014] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述臍帶間充質(zhì)干細胞的制備方法包括如下步 驟： _5] 步驟1 :取臍帶清洗后，剝?nèi)印㈧o脈管和外膜，剪碎成l_2mm2小塊，倒置培養(yǎng)；
[0016] 步驟2 :加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，2~3d后半量換液，培養(yǎng)6~8d，待細胞從組織塊 中爬出，棄去組織塊繼續(xù)培養(yǎng)；所述完全培養(yǎng)基包括X-VIV015無血清培養(yǎng)基和10ng/ml的 EGF ；
[0017] 步驟3 :待細胞生長至80 %融合，棄去培養(yǎng)液，清洗，經(jīng)0. 25 %胰酶消化l-2min，終 止消化，400g離心5min，收集細胞；
[0018] 步驟4 :在步驟3獲得的細胞中加所述完全培養(yǎng)基重懸，傳代培養(yǎng)，收集P2或P3R 細胞。
[0019] 具體的，在本發(fā)明的另一些實施方案中，所述臍帶間充質(zhì)干細胞的制備方法包括 如下步驟：
[0020] 1.取臍帶一根，PBS+200U/m的雙抗溶液沖洗3遍；
[0021] 2.臍帶剪成2cm長小段，剝?nèi)?、靜脈管和外膜，中間華氏膠剪碎成l-2mm2小塊， 均勻貼附于l〇cm培養(yǎng)皿，37°C 5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)倒放1-2h ;
[0022] 3?加入完全培養(yǎng)基（X-VIV015無血清培養(yǎng)基+10ng/ml的EGF) 5ml，2-3天后半量 換液，培養(yǎng)6-8天，待細胞從組織塊中爬出，棄去組織塊繼續(xù)培養(yǎng)；
[0023] 4.帶生長至80%融合，倒去培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，加0. 25%胰酶消化l-2min，加 FBS終止消化，收集細胞400g離心5min ;
[0024] 5.加完全培養(yǎng)基重懸，根據(jù)計數(shù)結(jié)果接種2-3皿；
[0025] 6.待細胞生長至80%融合后繼續(xù)傳代。取P2和P3代細胞上清液、P2或P3代細 胞進行制劑的制備。
[0026] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述生長因子的制備方法包括：
[0027] 步驟1 :取臍帶清洗后，剝?nèi)?、靜脈管和外膜，剪碎成l_2mm2小塊，倒置培養(yǎng)；
[0028] 步驟2 :加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，2~3d后半量換液，培養(yǎng)6~8d，待細胞從組織塊 中爬出，棄去組織塊繼續(xù)培養(yǎng)；所述完全培養(yǎng)基包括X-VIV015無血清培養(yǎng)基和10ng/ml的 EGF ；
[0029] 步驟3 :待細胞生長至80 %融合，棄去培養(yǎng)液，清洗，經(jīng)0. 25 %胰酶消化l-2min，終 止消化，400g離心5min，收集細胞；
[0030] 步驟4 :在步驟3獲得的細胞中加所述完全培養(yǎng)基重懸，傳代培養(yǎng)，收集P2或P3R 細胞上清液；
[0031] 步驟5 :取步驟4獲得的P2或P3代細胞上清液，經(jīng)0. 45 y m濾膜過濾除去大顆粒 物質(zhì)，濾液再經(jīng)〇. 22 y m濾膜過濾，除去3KDa以下小顆粒物質(zhì)。
[0032] 具體的，所述生長因子的制備方法包括：
[0033] 1.收集P2和P3代上清液，經(jīng)0. 45 y m濾膜過濾除去大顆粒物質(zhì)
[0034] 2.濾液再經(jīng)0. 22 y m濾膜過濾，除去3KDa以下小顆粒物質(zhì)
[0035] (濃縮過程采用Slice200切向流器，循環(huán)過濾的時間為3h)，濃縮比：濃縮前體積： 濃縮后體積為3~4:1。
[0036] 3.濃縮液用凍干機制成凍干粉，備用。
[0037] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述生長因子的制備方法還包括取步驟5獲得 的產(chǎn)品濃縮和凍干的步驟。
[0038] 本發(fā)明還提供了一種制劑，包含所述組合物和生理鹽水，所述生理鹽水在所述制 劑中的體積百分含量為70 %~90 %。
[0039] 具體的，整個制劑中：
[0040] 生長因子凍干粉濃度為：1. 5-2. 5mg/ml ;(都是以制劑為基準）
[0041] 臍帶間充質(zhì)干細胞密度為：5X105cell/ml
[0042] 透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量比為：5%-10%
[0043] 玻尿酸（透明質(zhì)酸）體積比為：10%-20%
[0044] 生理鹽水體積比為：70_90%。見圖1。
[0045] 本發(fā)明還提供了所述組合物或所述制劑在制備美容和/或抗衰老的藥物、保健品 和/或化妝品中的應用。
[0046] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述美容為修復缺損。更優(yōu)選的，所述美容為修 復面部缺損。
[0047] 本發(fā)明提供了一種組合物，包括臍帶間充質(zhì)干細胞、生長因子、透明質(zhì)酸或其鹽。 本發(fā)明還提供了具有快速高效修復面孔缺損的干細胞制劑。充分利用干細胞的增殖分化能 力、玻尿酸和透明質(zhì)酸鈉的保濕以及EGF的促進細胞生長作用，達到穩(wěn)定高效的修復面孔 缺損問題。
【附圖說明】
[0048] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0049] 圖1示制劑制備的流程圖；
[0050] 圖2示實施例4制備的制劑使用前后效果圖；其中圖2 (A)示實施例4制備的制劑 使用前效果圖；圖2(B)示實施例4制備的制劑使用前效果圖；
[0051] 圖3示實施例5中細胞增殖曲線。
【具體實施方式】
[0052] 本發(fā)明公開了一種組合物、制劑及其用途，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適 當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說 是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進 行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用 進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。
[0053] 術(shù)語解釋：
[0054] 透明質(zhì)酸鈉：透明質(zhì)酸鈉（SODIUM HYALUR0NATE)為從雞冠中提取的物質(zhì)， 也可通過乳酸球菌發(fā)酵制得，為白色或類白色顆?；蚍勰瑹o臭味，干燥時，氮含量為 2. 8% -4. 0%，葡糖醛酸含量為37. 0% -51. 0%。在化妝品領(lǐng)域中使用較多，有保濕作用。
[0055] 玻尿酸：玻尿酸是由雙糖單位（葡萄醛酸-N-乙硫氨基葡糖）組成的直鏈高分子 多醣，是一種組織中自然存在的物質(zhì)。玻尿酸大量存在于人體的結(jié)締組織及真皮層中，是一 種透明的膠狀物質(zhì)，具有強大的保濕功能，1公克的玻尿酸可以吸收500C. C的水分，相當于 甘油500倍吸水能力。在人類皮膚的真皮層中扮演了基質(zhì)的重要角色，無論是組織結(jié)構(gòu)上 整體的保養(yǎng)或是細胞之間的運送都具有很重要的功能。玻尿酸不僅有保持皮膚彈性的功 能，還能鎖住大量水分子，對組織具有保濕潤滑作用，使肌膚飽滿年輕有彈性，但隨著年齡 的增長，玻尿酸流失的速度比生長速度快時，肌膚也將漸漸變得缺乏水分，失去光澤彈性， 長久下來便出現(xiàn)皺紋等老化現(xiàn)象。
[0056] 表皮細胞生長因子：EGF是人體內(nèi)存在的一種生長因子，它的主要功能是促進皮 膚細胞的分裂。研究表明：極微量的EGF即能強烈刺激細胞生長，抑制衰老基因表達，阻止 皮膚衰老，使皮膚各組成份保持最佳生理狀態(tài)。此外，它還能刺激細胞外一些大分子（如透 明質(zhì)酸和膠原蛋白等）的合成與分泌，滋潤皮膚，是決定皮膚活力和健康的關(guān)鍵因素。研究 發(fā)現(xiàn)，EGF能促進上皮細胞、成纖維細胞的增值；增強表皮細胞的活力；延緩表皮細胞的老 化，使肌膚各組成成份保持最佳生理狀態(tài)。
[0057] 臍帶間充質(zhì)干細胞：臍帶間充質(zhì)干細胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs)是指存 在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞，它能分化成許多種組織細胞，具有廣闊的臨 床應用前景。臍帶間充質(zhì)干細胞（MSCs)具有較高的分化潛能，可向多個方向進行分化。它 在骨、軟骨