物可進一步制備治療與補體相關(guān)疾病的藥物；所述的與補 體相關(guān)疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性呼吸窘迫綜合征等疾病。
【附圖說明】
[0022] 圖1.:紫花地丁醇提物石油醚萃取部位雙環(huán)吉馬烷型倍半萜類化合物雙環(huán)吉馬 烷型倍半萜類化合物1和2的提取分離流程圖。
【具體實施方式】
[0023] 實施例1.雙環(huán)吉馬烷型倍半萜類化合物的制備
[0024] 取干燥的紫花地丁全草20kg，粉碎，用95 %乙醇室溫冷浸提?。?0LX5次）， 合并提取液并濃縮至無醇味，浸膏加水稀釋至2. 5L，依次以等體積石油醚^0-9(TC)、 乙酸乙酯、正丁醇萃?。ǜ?. 5LX3次），合并石油醚萃取液并濃縮至干，即得石油醚萃 取物323g。石油醚萃取部位（200g)經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次以石油醚-乙酸乙酯（石 油醚，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，1:1)梯度洗脫，得到7個流份（Fr.A-G)，其中流份 Fr.E(22. 2g)再經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑，30:1，20:1，15:1，10:1,5:1) 和SephadexLH-20 (氯仿-甲醇，1:1)反復(fù)純化，最后通過半制備HPLC[甲醇-水（65:35) 為洗脫劑]分離得到2個化合物，分別為isobicyclogermacrenal(l, 19mg)和madolin Y(2, 31mg) 〇
[0025] 實施例2.體外抗補體經(jīng)典途徑試驗
[0026] 取補體（豚鼠血清）0. 1ml，加入巴比妥緩沖液（BBS)配制成1:5的溶液，用BBS 對倍稀釋成1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640的溶液。取1:1000溶血素、各濃 度補體及2%羊紅細胞（SRBC)各0.Iml溶于0. 3mlBBS中，混勻，37°C水浴30min后放入 低溫高速離心機，在5000rpm、4°C條件下離心lOmin。分別取每管上清0. 2ml于96孔板，在 405nm測定其吸光度。實驗同時設(shè)置全溶血組（0.Iml2%SRBC溶于0. 5ml三蒸水）。以三 蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準，計算溶血率。以補體稀釋度為X軸，各稀釋濃度補體 造成的溶血百分率為Y軸作圖。選擇達到相似高溶血率的最低補體濃度作為確保體系能正 常溶血所需的臨界補體濃度。取臨界濃度的補體與供試品混勻，于37°C預(yù)水浴IOmin后，加 入適量BBS、溶血素和2%SRBC。將每管37°C水浴30min后放入低溫高速離心機，5000rpm、 4°C條件下離心IOmin后分別取每管上清0. 2ml于96孔板，405nm下測定吸光度。實驗同時 設(shè)置供試品對照組、補體組和全溶血組。將供試品吸光度值扣除相應(yīng)供試品對照組吸光度 值后計算溶血率。以供試品濃度作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作圖，計算50%抑制溶血所 需供試品的濃度（CH5。）；結(jié)果表明（如表2所示），化合物1和2對補體系統(tǒng)經(jīng)典途徑有抑 制作用（mean土SD,n= 3)。
[0027] 實施例3.體外抗補體旁路途徑試驗
[0028] 取補體（人血清）0? 2ml，加入AP稀釋（巴比妥緩沖液，pH= 7. 4,含5mM Mg2+, 8mMEGTA)液配制成 1:5 的溶液，并對倍稀釋成 1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320 和 1:640的溶液。取各濃度補體0. 15ml、AP稀釋液0. 15ml及0. 5 %兔紅細胞（RE)O. 20ml，混 勻，37°C水浴30min后置于低溫高速離心機，在5000rpm、4°C條件下離心lOmin。分別取每 管上清0. 2ml于96孔板，在405nm測定吸光度。實驗同時設(shè)置全溶血組（0. 20ml0. 5%RE 溶于0. 3ml三蒸水）。以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準，計算溶血率。以補體稀釋 度為X軸，各稀釋濃度補體造成的溶血百分率為Y軸作圖。選擇達到相似高溶血率的最低 補體濃度作為確保體系能正常溶血所需的臨界補體濃度。取確定的臨界濃度的補體與供試 品混勻，于37°C預(yù)水浴IOmin后，加入0. 2ml0. 5%RE。將每管37°C水浴30min后置于低溫 高速離心機，5000rpm、4°C條件下離心IOmin后，分別取每管上清0. 2ml于96孔板，405nm下 測定其吸光度。實驗同時設(shè)置供試品對照組、補體組和全溶血組。將供試品吸光度值扣除 相應(yīng)供試品對照組吸光度值后計算溶血率。以供試品濃度作為X軸，溶血抑制率作為Y軸 作圖，計算50%抑制溶血所需供試品的濃度（APJ;結(jié)果表明（如表2所示），化合物1和 2對補體系統(tǒng)旁路途徑有抑制作用（mean土SD，n= 3)
[0029] 本發(fā)明中實驗采用的試劑均為本領(lǐng)域公知技術(shù)，可市購。
[0030] 表2.化合物1和2對補體系統(tǒng)經(jīng)典途徑和旁路途徑的抑制作用（mean土SD,n= 3)
[0031]
【主權(quán)項】
1. 式I的雙環(huán)吉馬烷型倍半萜類化合物在制備抗補體藥物中的用途：其中，當(dāng)雙鍵為八1(1°)，1?1為11，1? 2為11時，化合物為18〇13；[〇5^1(^61'1]^(^6仙1(1);;當(dāng) 雙鍵為A_5)，札為〇H，R2為0H時，化合物為madolinY(2)。2. 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物1和2對補體系統(tǒng)經(jīng)典途徑。3. 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物1和2抑制補體系統(tǒng)旁路途 徑。4. 按權(quán)利要求1的雙環(huán)吉馬烷型倍半萜類化合物的制備方法，其特征在于，其包括： 取干燥的紫花地丁全草，粉碎，用95 %乙醇室溫冷浸提取5次，合并提取液并濃縮 至無醇味，浸膏加水稀釋，依次以等體積石油醚60-90°C、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次， 合并石油醚萃取液并濃縮至干，即得石油醚萃取物；石油醚萃取部位經(jīng)硅膠柱色譜分 離，依次以石油醚-乙酸乙酯（石油醚，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，1:1)梯度洗脫，得 到7個流份（Fr.A-G)，其中流份Fr.E再經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑， 30:1,20:1，15:1，10:1,5:1)和S印hadexLH-20(氯仿-甲醇，1:1)反復(fù)純化，最后通 過半制備HPLC[甲醇-水（65:35)為洗脫劑]分離得到2個倍半萜類化合物，分別為 isobicyclogermacrenal(l)和madolinY(2)〇
【專利摘要】本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及式I的雙環(huán)吉馬烷型倍半萜類化合物及其在制備抗補體藥物中的新用途。本發(fā)明從堇菜科植物紫花地丁(Viola？yedoensis？Makino)的干燥全草乙醇提取物的石油醚萃取部位分離得到2個雙環(huán)吉馬烷型倍半萜類化合物，并經(jīng)試驗證實其對補體系統(tǒng)經(jīng)典途徑和旁路途徑均有不同抑制作用：CH50和AP50分別為0.14-0.22mg/ml和0.33-0.44mg/ml。本發(fā)明的倍半萜類化合物可用于制備抗補體藥物并進一步制備治療與補體相關(guān)疾病的藥物。
【IPC分類】A61P29/00, A61P37/02, A61P19/02, A61P11/00, A61K31/11
【公開號】CN105078937
【申請?zhí)枴緾N201410201402
【發(fā)明人】陳道峰, 程志紅, 杜冬生
【申請人】復(fù)旦大學(xué)
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2014年5月13日