一種谷胱甘肽微球的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及谷胱甘肽，尤其是涉及一種谷胱甘肽微球的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷胱甘肽（GSH)屬于含有巰基的小分子活性肽，廣泛分布于機(jī)體中，是細(xì)胞內(nèi)非 蛋白硫氫基團(tuán)主要的組成部分，在生物體內(nèi)有著多種重要的生理功能，對(duì)于維持生物體內(nèi) 適宜的氧化還原環(huán)境起著至關(guān)重要的作用，具有延緩衰老、抗疲勞等作用，但是GSH極易被 氧化，使其生理保健作用效果降低，微膠囊化GSH可以克服不同成分間的反應(yīng)且可以對(duì)其 起到保護(hù)作用，極大地保持谷胱甘肽的生理特性，提高其穩(wěn)定性。
[0003] 水凝膠體系是目前提高蛋白質(zhì)以及多肽類藥物體內(nèi)穩(wěn)定性以及實(shí)現(xiàn)腸道靶向釋 放的重要方法。水凝膠是一類具有親水基團(tuán)，能被水溶脹但不溶于水的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu) 的聚合物，能夠感知外界刺激的微小變化，如溫度、PH值、離子強(qiáng)度、電場(chǎng)、磁場(chǎng)等，通過體積 的溶脹或收縮對(duì)刺激做出敏感性的相應(yīng)。水凝膠的這一特點(diǎn)使它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、生物酶 的固定等方面有廣泛的應(yīng)用前景。目前在蛋白質(zhì)和多肽靶向輸送中應(yīng)用得最多的是PH敏 感性水凝膠。殼聚糖-海藻酸鈉水凝膠體系已被廣泛用于蛋白質(zhì)和多肽類藥物的腸道靶向 釋放。
[0004] SPG膜乳化法主要用于制備尺寸均一的乳液、乳珠、微球、微膠囊等，可用于制備 W/0、0/W、W/O/W、0/W/0不同乳液，實(shí)現(xiàn)乳液的尺寸均一性和可控性、微球表面功能的可控性 和穩(wěn)定性、多孔微球結(jié)構(gòu)的可控性和穩(wěn)定性；實(shí)現(xiàn)均一乳液大規(guī)模制備的可行性；多孔微 球或緩釋膠囊粒徑的可控性等。SPG膜乳化法制備的微球，粒徑范圍為2~100 y m，在各個(gè) 領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，在生物工程領(lǐng)域可以作為活性物質(zhì)的分離介質(zhì)，在藥學(xué)領(lǐng)域可以作為 控制藥物釋放的載體，在攝影領(lǐng)域可以作為固液態(tài)的調(diào)色劑等。其中藥學(xué)和食品是膜乳化 應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域，通過不同的制備方式將水溶性的抗癌藥物包埋制備成微球或微囊，提 高生物利用率，均一的乳液還可以有效保持食品風(fēng)味和良好口感，掩蓋住個(gè)別食品的刺激 性氣味等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種谷胱甘肽微球的制備方法。
[0006] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0007] 1)將GSH溶解在SAL溶液中作為水相；油相為液體石蠟和石油醚混合物，所述混 合物中含乳化劑，將烘干的SPG膜放入油相中超聲，安裝到SPG膜乳化器中，在氮?dú)鈮毫ο?水相通過SPG膜，進(jìn)入到油相中，得SAL乳狀液；
[0008] 2)將CaCl2溶液與步驟1)中的油相混合，攪拌超聲后形成乳狀液，再與步驟1)得 到的SAL乳狀液混合，攪拌后，得乳白色乳狀液，再離心，除去上清液，清洗，再除去上清液 后，得到海藻酸鈉-鈣微球，抽濾清洗，除去微球表面的有機(jī)溶劑，然后將微球分散到O-CMC 溶液中，得負(fù)載GSH的O-CMC-SAL微球，再抽濾，除去表面殘留的0-CMC，干燥后即得谷胱甘 肽微球。
[0009] 在步驟1)中，所述SAL溶液可采用體積百分比為1. 5%，pH為4. 2的SAL溶液； 所述油相中液體石蠟與石油醚的體積比可為7:5 ;所述乳化劑可采用P0-500乳化劑，所述 乳化劑的含量按質(zhì)量百分比可為液體石蠟和石油醚混合物的4% ;所述超聲的時(shí)間可為 30min ;所述SPG膜的孔徑可為20 y m ;所制得的SAL乳狀液為W/0型SAL乳狀液，在SAL乳 狀液中水相與油相的體積比可為1 : 10。
[0010] 在步驟2)中，所述CaCl2溶液可采用體積百分比為2%，pH為6的CaCl 2溶液；所 述CaCl2溶液與油相的體積比可為I : 1;所述攪拌的條件可為300rmp下攪拌5h;所述清 洗可采用石油醚離心清洗2次，離心的條件可為SOOOrmp下離心5min，20°C ;所述抽濾清洗 可采用去離子水抽濾清洗；所述O-CMC溶液的體積百分比濃度可為0. 5%;所述再抽濾可采 用去離子水抽濾；所述干燥可采用真空冷凍干燥24h。
[0011] 本發(fā)明以海藻酸鈉（sodium alginate, SAL)和羧甲基殼聚糖（0-carboxymethyl chitosan，0-CMC)為壁材，以CaCl2S交聯(lián)劑，采用SPG膜乳化法制備谷胱甘肽微球，并對(duì) 微球的形態(tài)結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性進(jìn)行分析。
【附圖說明】
[0012] 圖1為谷胱甘肽微球掃描電鏡圖。
[0013] 圖2為空微球、SGH微球的紅外光譜圖。
[0014] 圖3為微球的差示量熱掃描圖。
[0015] 圖4為GSH微球及空微球的熱重分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0017] 1.谷胱甘肽微球的制備
[0018] 在室溫（20°C )下，準(zhǔn)確稱取一定量的GSH，使其充分溶解在1.5% (v/w)pH4.2 的SAL溶液中作為水相；油相為液體石蠟和石油醚7:5(v/v)混合物，其中含4% (w/w)的 P0-500乳化劑。將烘干的SPG膜放入油相中超聲30min，安裝到SPG膜乳化器中。在氮?dú)?壓力下50mL水相通過孔徑20 y m的SPG膜，進(jìn)入到500mL油相中，形成W/0型SAL乳狀液 (水油體積比為1:10)。
[0019] 將50mL 2% (v/w)的pH = 6的CaCl2溶液與50mL上述的油相混合，攪拌超聲后 形成均一乳狀液，再與SAL乳狀液混合，為了保證形成均一的水凝膠微球，混合過程一定要 緩慢進(jìn)行?；旌虾?00rmp攪拌5h，形成均一的乳白色乳狀液，倒入離心管中離心后，除去上 清液，再用石油醚離心清洗2次（SOOOrmp，5min，20 °C )，除去上清液后，得到海藻酸鈉-鈣 微球，用去離子水抽濾清洗，除去微球表面的有機(jī)溶劑；然后將微球分散到50mL 0.5% (v/ w)的O-CMC溶液中，300rmp攪拌Ih，制備得到負(fù)載GSH的O-CMC-SAL微球，得到的微球用去 離子水抽濾，除去表面殘留的0-CMC，真空冷凍干燥24h，得到谷胱甘肽微球。
[0020] 2. GSH微球包埋率的測(cè)定
[0021] 2. I GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0022] 用高效液相色譜法繪制谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體步驟如下：準(zhǔn)確稱取GSH標(biāo)準(zhǔn) 品適量，加入去離子水溶解成質(zhì)量濃度為500mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再按一定的比例稀釋成 25 y g/L、125 y g/L、250 y g/L、375 y g/L、500 y g/L 和 625 y g/L 濃度的溶液，經(jīng) 0? 22 y m 的 濾膜過濾后，進(jìn)樣測(cè)定。色譜條件為：Eclipse XDB-C18反相色譜柱（4. 6X250mm，5iim)，流 動(dòng)相乙腈：水=17 : 83,其中水相中含有0.05%三氟乙酸（TFA)，超聲脫氣15min，進(jìn)樣流 速為1.0 mL/min，柱溫保持30°C，檢測(cè)波長(zhǎng)為199nm，進(jìn)樣量為20 y L。以谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液 的濃度（C)為橫坐標(biāo)，峰面積（A)為縱坐標(biāo)作線性回歸方程，繪制谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0023] 2. 2微球表面GSH含量的測(cè)定
[0024] 稱取一定質(zhì)量的凍干微球，加入ImL去離子水，離心lmin，小心吸取上清液20 y L， 稀釋10倍，經(jīng)0. 22 y m濾膜過濾，取20 y L進(jìn)樣，根據(jù)2. 1中得到的GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算微球 表面的GSH含量，記為N。
[0025] 2. 3微球GSH總含量的測(cè)定
[0026] pH7. 4 緩沖液的配制：準(zhǔn)確量取 81mL 0.2mol/L Na2HPO4溶液和 19mL 0.2mol/L 似氏?04溶液混合，定容到lOOOmL，配制0. 02mol/L的pH7. 4磷酸緩沖液。
[0027] 稱取一定質(zhì)量的凍干微球，加入ImL pH7. 4的磷酸緩沖液，超聲30min后使微球溶 脹破裂，離心Imin，取上清液，經(jīng)0. 22 y m濾膜過濾后，取20 y L進(jìn)樣，根據(jù)2. 1中得到的GSH 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算微球中GSH總含量，記為WB。
[0028] 2.4 GSH包埋率的測(cè)定
[0029] 微球中GSH的包埋率按如下公式計(jì)算：
[0030]
[0031] 式中：N-微球表面GSH含量；
[0032] Wb-微球GSH總含量。