一種葉酸修飾的雄黃-介孔氧化硅納米復(fù)合藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明專利涉及介孔材料制備與藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種葉酸修飾的雄 黃-介孔氧化硅納米復(fù)合藥物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 礦物藥雄黃（Realgar)，為中醫(yī)學(xué)中應(yīng)用歷史悠久的中藥，最早載于《神農(nóng)本草 經(jīng)》，主要成分為四硫化四砷（As 4S4),并夾雜少量砒霜（As2O3)及其它重金屬鹽，用于解毒 殺蟲，燥濕，去痰，截瘧等。自20世紀(jì)50年代以來，國內(nèi)許多學(xué)者將含雄黃的復(fù)方制劑或 單味雄黃用于臨床治療血液系統(tǒng)的腫瘤及人體其他部位的腫瘤，取得了很好的療效。且由 于其毒性低于砒霜注射劑，雄黃被推薦為治療急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL)的二線化療 M(Wu J Z, Shao Y B, Liu J L, et al. The medicinal use of realgar (As4S4) and its recent development as ananticancer agent[J]. Journal ofEthnopharmacology,2011,135 (3)： 595-602)。目前研究證明雄黃抗腫瘤作用的機(jī)理為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、抑制核酸 合成、作為血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制劑和直接細(xì)胞毒作用等（劉嶸，濮德敏.雄黃的研究進(jìn)展[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007,18(4) :982-984)。但是雄黃為硫化物類礦物，難溶于水及大部分有機(jī) 溶劑，目前的臨床應(yīng)用中一直存在口服劑量大、潛在毒性大等問題。
[0003] 目前通常采用氣流和球磨等微粉化技術(shù)將雄黃粒徑減小到微、納米級(jí)尺度水平， 提高其生物利用度，但現(xiàn)有這些方法仍然存在不少缺點(diǎn)，例如：粒徑難以控制、穩(wěn)定性差、水 溶性差、易發(fā)生氧化和團(tuán)聚等。楊祥良等（Yang X L，Xu H B，Ye H Q，et al. Nanometer realgar solid dispersion and its preparation method :China，CN1478486[P]. 2004-03-03)以納 米雄黃為活性成分，以高分子聚合物為載體，添加抗氧化劑和表面活性劑，通過熔融法和溶 劑揮發(fā)法制備了納米雄黃固體分散體，解決了納米雄黃的氧化與團(tuán)聚問題。沈星燦等（Shen X C, Liang H, Chen Y, et al. Method for preparing nanometer realgar gel and nanometer realgar with biomacromolecule template to regulate shape and particle thereof ： China, CN100374463C[P]. 2008-03-12)采用化學(xué)法，以生物大分子為模板調(diào)控形貌與粒徑 制得不同形貌與粒徑的納米雄黃。然而上述方法制備的納米雄黃在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì) 正常細(xì)胞也有一定的毒副作用。
[0004] 葉酸受體在大部分人體腫瘤細(xì)胞上都存在過度表達(dá)（Morelli C，Maris P，Sisci D, et al. PEG-templated mesoporous silica nanoparticles exclusively target cancer cells [J]. Nanoscale，2011，3 (8) :3198-3207)，因此，在藥物制劑設(shè)計(jì)中通常將葉酸作 為主動(dòng)靶向識(shí)別配體。而介孔氧化硅納米粒子表面具有豐富的可接支位點(diǎn)，易于葉酸修 飾，同時(shí)該載體具有高的負(fù)載量、形貌可控性以及低的系統(tǒng)毒性等優(yōu)點(diǎn)（Tang F Q，Li L L, Chen D. Mesoporous silica nanoparticles ：synthesis, biocompatibility and drug delivery [J] ? Advanced Materials, 2012, 24 (12) :1504-1534)，并且使雄黃能在納米水平 均一分散于介孔腔，因此選擇其作為雄黃靶向輸送載體具有良好的可行性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開了一種葉酸修飾的介孔氧化硅納米粒子，它具有大比表面積和孔體 積、孔徑分布窄、粒徑均勻以及單分散的球形形貌，適合作為藥物載體，在藥物傳遞領(lǐng)域具 有良好的應(yīng)用前景。
[0006] 本發(fā)明的葉酸修飾的介孔氧化硅納米粒子能夠通過物理吸附負(fù)載雄黃，形成葉酸 修飾的雄黃-介孔氧化硅納米復(fù)合藥物，期望其靜注后通過與腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體特 異性結(jié)合，選擇性地在腫瘤部位累積并被細(xì)胞吞噬，降低雄黃對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用，并實(shí) 現(xiàn)有效的治療作用。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：以正硅酸四乙酯為硅源，十六烷基 三甲基溴化銨為模板劑，乙醇為助溶劑，三乙醇胺為螯合劑在堿性條件下合成介孔氧化硅 納米粒子，經(jīng)溶劑萃取法除去模板劑后通過后嫁接法在其表面鍵合氨丙基，再通過偶聯(lián)反 應(yīng)修飾葉酸，即得到葉酸修飾的介孔氧化硅納米粒子。然后將雄黃溶于無水乙二胺形成簇 溶液（As 4S4-NH2C2H4NH 2)，離心除去其他不溶性礦物成分，再用去離子水稀釋，配制成一定濃 度的雄黃乙二胺溶液，通過高速振蕩的方式負(fù)載于葉酸修飾的介孔氧化硅納米粒子的孔道 中，即得葉酸修飾的雄黃-介孔氧化硅納米復(fù)合藥物。
[0008] 葉酸修飾的雄黃-介孔氧化硅納米復(fù)合藥物的合成過程如下：
[0009] 上述制備方法中正硅酸四乙酯：十六烷基三甲基溴化銨：三乙醇胺：水：乙醇 的摩爾比為1 : 0.2~0.3 : 0.8~LO : 130~150 : 7.0~13.0。在此范圍內(nèi)，通過 改變正硅酸四乙酯與三乙醇胺或者正硅酸四乙酯與乙醇的比例可以得到不同粒徑大小的 介孔氧化娃納米粒子。
[0010] 雄黃-介孔氧化硅納米復(fù)合物的制備方法中：乙二胺：水的體積比為1 : 0. 33~ 1 : 3,雄黃濃度為2~20mg/mL，載體量為5~20mg，負(fù)載時(shí)間為0~4小時(shí)。
[0011] 更為優(yōu)選的制備方法如下：
[0012] a.室溫下，稱取適量陽離子表面活性劑置于圓底燒瓶中，加入去離子水后于40~ 80°C加熱攪拌，溶解后依次加入無水乙醇和三乙醇胺，攪拌均勻后逐滴加入正硅酸四乙酯， 保持40~80°C繼續(xù)攪拌1~3小時(shí)；
[0013] b.將反應(yīng)混合物離心，用去離子水洗至中性，再用無水乙醇洗滌后于60°C真空干 燥；
[0014] C.用含鹽酸的乙醇溶液除去模板劑，60°C真空干燥，得到介孔氧化硅納米粒子；
[0015] d.室溫下，稱取適量介孔氧化硅納米粒子置于圓底燒瓶中，加入無水乙醇攪拌分 散，量取適量3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解于無水乙醇后加入上述圓底燒瓶，室溫?cái)嚢?0~ 60小時(shí)；
[0016] e.將反應(yīng)混合物離心，用無水乙醇洗滌后置60°C真空干燥，得到氨基化的介孔氧 化石圭納米粒子；
[0017] f.室溫下，稱取適量葉酸于圓底燒瓶中，加入二甲亞砜超聲溶解，依次加入N-羥 基丁二酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫避光攪拌1小時(shí)后加 入適量氨基化的介孔氧化硅納米粒子，繼續(xù)避光攪拌10~30小時(shí)；
[0018] g.將反應(yīng)混合物離心，用磷酸鹽緩沖液洗滌后真空干燥，得到葉酸修飾的介孔氧 化石圭納米粒子。
[0019] h.將雄黃溶于無水乙二胺，溶解后離心除去不溶性礦物成分，再用去離子水稀釋， 使得乙二胺：水的體積比為1 : 0. 33~1 : 3,配制成雄黃濃度為2~20mg/mL的雄黃乙 二胺溶液；
[0020] i.稱取5~20mg介孔氧化硅納米粒子置于塑料離心管中，加入上述雄黃乙二胺溶 液，室溫下置于高速振蕩器振蕩0~4小時(shí)；
[0021] j.離心，用去離子水洗滌，合并上清液并轉(zhuǎn)移至三角燒瓶中進(jìn)行濕法消解，用原子 熒光光譜儀測定負(fù)載前后樣品中砷濃度的變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算雄黃負(fù)載量。
[0022] k.用葉酸修飾的介孔氧化硅納米粒子替換i中的介孔氧化硅納米粒子，用優(yōu)化得 到的條件考察其對(duì)雄黃的負(fù)載量。
[0023] 本發(fā)明的創(chuàng)造性在于：
[0024] 1.本發(fā)明中的介孔氧化硅材料的制備使用三乙醇胺來絡(luò)合硅物種，該制備方法與 稀溶液法以及微乳法相比合成過程簡單，產(chǎn)率高，后處理方便。
[0025] 2.本發(fā)明制備的介孔氧化硅納米粒子具有蠕蟲狀孔道的球形形貌，粒徑均一，約 為80~IOOnm,見圖1，比表面積和孔體積分別為973m 2/g和I. 01cm3/g，具有有序的介孔結(jié) 構(gòu)，窄的孔徑分布，見圖2至圖4,該材料表面具有較多的活性位點(diǎn)，易于被修飾，同時(shí)具有 高的負(fù)載量、形貌可控性以及低的系統(tǒng)毒性等優(yōu)點(diǎn)，適合作為藥物載體。
[0026] 3.介孔氧化硅納米粒子作為藥物載體是近十年來的研究熱點(diǎn)，但通常都是負(fù)載傳 遞分子類藥物，負(fù)載礦物藥雄黃的研究還未見文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明通過考察乙二胺與水的體 積比，雄黃乙二胺溶液的濃度，載體量以及振蕩時(shí)間發(fā)現(xiàn)，介孔氧化硅納米粒子對(duì)雄黃有一 定的負(fù)載能力，見圖6至圖9,且其形貌和結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯的改變，見圖10,負(fù)載量約為8%， 圖11是雄黃-介孔氧化硅納米復(fù)合物的能譜分析圖，進(jìn)一步說明雄黃在納米水平負(fù)載于介 孔氧化硅納米粒子中，在其表面修飾葉酸后形成葉酸修飾的雄黃-介孔氧化硅納米復(fù)合藥 物，但其靶向特性還需進(jìn)一步經(jīng)過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
【附圖說明】
[0027] 圖1為實(shí)施例1合成的介孔氧化硅納米粒子的透射電鏡（TEM)照片；
[0028] 圖2為實(shí)施例1合成的介孔氧化硅納米粒子的小角X射線衍射（XRD)圖譜；
[0029] 圖3為實(shí)施例1合成的介孔氧化硅納米粒子的氮?dú)馕?脫附等溫線曲線；
[0030] 圖4為實(shí)施例1合成的介孔氧化硅納米粒子的孔徑分布曲線；
[0031] 圖5為實(shí)施例3合成的葉酸修飾的介孔氧化硅納米粒子的紅外光譜圖；
[0032] 圖6為實(shí)施例4中乙二胺與水體積比與載藥率的關(guān)系曲線；
[0033] 圖7為實(shí)施例5中雄黃濃度與載藥率的關(guān)系曲線；
[0034] 圖8為實(shí)施例6中載體的量與載藥率的關(guān)系曲線；
[0035] 圖9為實(shí)施例7中振蕩時(shí)間與載藥率的關(guān)系曲線；
[0036] 圖10為實(shí)施例8中雄黃-介孔氧化硅納米復(fù)合藥物的透射電鏡（TEM)照片；
[0037] 圖11為實(shí)施例8中雄黃-介孔氧化硅納米復(fù)合藥物的能譜分析（EDX)圖譜
【具體實(shí)施方式