一種氧化納米纖維素/膠原蛋白復(fù)合海綿的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)用復(fù)合材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種膠原蛋白復(fù)合海綿的制備方 法，用于組織工程支架材料。
【背景技術(shù)】
[0002] 膠原蛋白（也稱膠原）是動物結(jié)締組織(骨、皮膚、腱、韌帶等）的重要組分，也是哺 乳動物體內(nèi)分布最廣、含量最豐富的一種大分子蛋白質(zhì)，約占動物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25~ 30%，起保護(hù)基體、支撐器官的作用。膠原蛋白的種類很多，目前已發(fā)現(xiàn)有26種，按不同類型 可分為I、II、III、IV型等，其中I型膠原蛋白廣泛存在于皮膚和跟腱中，相對較易被提取， 因此得到更多的應(yīng)用。而其他類型的膠原蛋白由于價(jià)格昂貴，目前僅處于實(shí)驗(yàn)室研究階段， 不適宜大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。膠原的提取過程較為繁瑣，目前有以下幾種方法：①傳統(tǒng)提取 法，也是目前最主要的提取方式，該法利用酸、堿水解或酶解的方法從動物結(jié)締組織(豬皮、 牛腱等）提??；②化學(xué)合成法，即利用化學(xué)方法直接合成膠原蛋白，但該法得到的膠原不具 有生物活性，且技術(shù)復(fù)雜成本高；③基因工程法，即選用適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞生產(chǎn)重組人膠原細(xì) 胞，該法是近幾年的研究熱點(diǎn)。
[0003] 膠原蛋白在食品領(lǐng)域和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用已得到了國內(nèi)外的一致認(rèn)可。而膠原 蛋白在醫(yī)用生物材料方面的研究和應(yīng)用也已有相關(guān)報(bào)道，美國在上世紀(jì)90年代就批準(zhǔn)將 Apligraf用于靜脈潰瘍的治療，國內(nèi)對于膠原蛋白用作止血材料的研究也取得了一定的進(jìn) 展。由于膠原蛋白本質(zhì)上就是一種天然組織支架材料，因此膠原蛋白成為構(gòu)建組織工程支 架的理想材料，如皮膚、骨組織、血管等器官的支架，之后體內(nèi)組織細(xì)胞爬入支架內(nèi)與其生 長融合，引導(dǎo)組織再生。純膠原蛋白組織工程支架具有良好的生物相容性、可塑性、易加工 并能有效促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖等優(yōu)點(diǎn)。但是，膠原蛋白作為純天然高分子，最大的缺點(diǎn)就是 力學(xué)強(qiáng)度差，降解速度過快，在體內(nèi)使用時(shí)難以有足夠的強(qiáng)度來支撐組織重建，使其不能達(dá) 到作為細(xì)胞支架的要求，大大限制了膠原在醫(yī)用領(lǐng)域的應(yīng)用。因此近年來，膠原蛋白在生物 醫(yī)用領(lǐng)域方面的應(yīng)用以及對其改性以提高其支架性能成為研究的熱點(diǎn)。
[0004] 由于具有資源豐富、可再生、原料易得、生物降解、生物相容、價(jià)格低廉、較高機(jī)械 性能等優(yōu)異性能，纖維素在醫(yī)用材料領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，其中最有應(yīng)用前景的材料就 是納米微晶纖維素（Nanocrystal cellulose，NCC)，納米微晶纖維素可通過天然纖維素或 微晶纖維素經(jīng)強(qiáng)酸降解制得。纖維素大分子中的(6-(1, 4)糖苷鍵是一種縮醛鍵，對酸特 別敏感，在適當(dāng)?shù)臍潆x子濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間的作用下，糖苷鍵斷裂，聚合度下降，形成結(jié) 晶度很高的納米微晶纖維素。它不僅具有纖維素的基本結(jié)構(gòu)與性能，如特殊的粘性、成膠 性、懸浮性、穩(wěn)定性和光學(xué)特性等，還具有納米顆粒的特性，如巨大的比表面積、超強(qiáng)的吸附 能力、高的反應(yīng)活性、楊氏模量和抗張強(qiáng)度有指數(shù)級的增長，且能夠長期穩(wěn)定的分散在體系 中，被廣泛用于復(fù)合材料的增強(qiáng)劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種氧化納米纖維素/膠原蛋白復(fù)合海綿的制備方法，通過 氧化納米纖維素增強(qiáng)膠原蛋白，使得膠原蛋白的物理機(jī)械性能提高，同時(shí)不會在體系中引 入其他有毒的物質(zhì)，使其不具備細(xì)胞毒性，更好的應(yīng)用于組織工程支架材料，解決膠原蛋白 在單獨(dú)使用過程中力學(xué)性能差、降解速度過快的問題。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種氧化納米纖維素/膠原蛋白復(fù)合海綿的制備方法，按照以下步驟進(jìn)行： 一、 膠原蛋白海綿的制備： 取低溫（〇~4r ))冷凍純凈的牛跟腱，剪碎，放入Na2CO3溶液（lwt%)中浸泡6~24h， 取出晾干后低溫冷凍（〇~4°C )保存。
[0007] 藝將5~15g牛跟腱碎末放入含3~5g胃蛋白酶的醋酸溶液（3wt%)中，置于0~5r 恒溫水浴池中緩慢攪拌48~72h，至反應(yīng)液粘度不再變化，高速冷凍離心機(jī)離心15~45min， 取上層透明粘性清液，即得到粗提取的膠原蛋白原液； 在膠原蛋白液中快速加入l~5g氯化鈉粉末且不斷用玻璃棒攪拌，在3~5°C條件下 鹽析，有白色塊狀沉淀析出，持續(xù)攪拌至析出完全，低溫（〇~4°C )靜置6~24h，濾出白色沉 淀，放入Tris-HCl緩沖液（pH=7)中溶脹6~24h ; 將溶脹后的膠原溶液放入透析袋中，在〇. l~〇.5mol/L的乙酸溶液中分別透析 ^-481!，再用蒸餾水透析至透析袋中膠原溶液透明，得到純凈的膠原溶液； (gi取膠原溶液置于模具中，在-10~_20°C預(yù)凍20~40h，預(yù)凍后放入冷凍干燥機(jī)中，在溫 度-56~-20°C、真空度10~40Pa的條件下處理20~40h，得到膠原蛋白海綿； 二、 納米纖維素的制備： 丨§將I. 0~5. Og微晶纖維素放于適量50~70 wt%硫酸溶液中且磁力攪拌，控制微晶纖 維素與硫酸二者之間的質(zhì)量比為1:15~45,在30~50°C溫度的水浴條件下反應(yīng)l~3h ; (|j.將反應(yīng)液傾入400~500ml的去離子水中結(jié)束反應(yīng)，靜置，去除上清液；對懸浮液去離 子水離心洗滌4~6次，測得pH值5~7;超聲處理15~30min后將溶膠放入透析袋(截留分子 量3000)中進(jìn)行純化處理4~6天，去除剩余的SO42 ; (f丨將純化后的納米晶纖維素在-10~_20°C預(yù)凍20~40h，預(yù)凍后放入冷凍干燥機(jī)中，在 溫度-56~-20°C、真空度10~40Pa的條件下處理20~40h，得到白色的納米纖維素粉末。
[0008] 三、氧化納米纖維素的制備： ① 將0. 1~1. Og步驟二中制備的納米纖維素溶于裝有50~200mL去離子水，超聲處理 30~45min ； ② 用NaOH標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)節(jié)pH至10~11，加入一定量TEMPO和NaBr混合均勻，控制納米纖 維素、TEMPO 和 NaBr 質(zhì)量比為 5~15:1:10,取 NaClO 調(diào)節(jié) pH 在 10~1 L 8 ; ③ 反應(yīng)結(jié)束倒入過量的乙醇終止反應(yīng)，離心處理，去除上層液體，使用無水乙醇離心洗 滌4~6次； ④ 用HCl溶液進(jìn)行酸化處理3~4h，用乙醇進(jìn)行離心洗滌4~6次，溶于去離子水中， 在-10~-20°C預(yù)凍20~40h，預(yù)凍后放入冷凍干燥機(jī)中，在溫度-56~-20°C、真空度10~40Pa 的條件下處理20~40h，得到白色帶有羧基基團(tuán)的氧化納米纖維素。
[0009] 四、氧化納米纖維素/膠原蛋白復(fù)合海綿的制備： 取純膠原〇. l~〇. 5g，剪碎后放入培養(yǎng)皿中，加入10~50ml醋酸溶液，且磁力攪拌至 膠原完全溶解得到較為粘稠的膠原溶液，將氧化納米纖維素加入膠原溶液中，攪拌均勻，得 到氧化納米纖維素/膠原蛋白復(fù)合溶液，控制氧化納米纖維素與純膠原的質(zhì)量比為1~1〇 : 100 ； 將氧化納米纖維素/膠原蛋白復(fù)合溶液在-10~-2(TC預(yù)凍20~40h，預(yù)凍后放入冷凍 干燥機(jī)中，在溫度-56~-20°C、真空度10~40Pa的條件下處理20~40h，得到氧化納米纖維素 /膠原蛋白復(fù)合海綿。
[0010] 本發(fā)明具有以下有益效果： 1、本發(fā)明利用纖維素與膠原蛋白之間的氫鍵作用使纖維素在膠原溶液中較好的相容， 最終使得膠原蛋白的物理機(jī)械性能提高，解決了膠原蛋白在單獨(dú)使用過程中力學(xué)性能差、 降解速度過快的問題。
[0011] 2、本發(fā)明不會在體系中引入其他有毒的物質(zhì)，使其不具備細(xì)胞毒性，更好的應(yīng)用 于組織工程支架材料。
[0012] 3、本發(fā)明的制備過程無需特殊設(shè)備、反應(yīng)條件溫和，可實(shí)現(xiàn)氧化納米纖維素/膠 原蛋白復(fù)合海綿工廠化生產(chǎn)。
[0013] 4、本發(fā)明制備過程中所用的原料為可再生資源且成本低，可實(shí)現(xiàn)氧化納米纖維素 /膠原蛋白復(fù)合海綿的低成本化。
[0014] 5、本發(fā)明制備的氧化納米纖維素/膠原蛋白復(fù)合海綿吸水率下降50~60%，溶失率 下降了 30~40%，最大承受力增加了 2~3倍。
【附圖說明】
[0015] 圖1為氧化納米纖維素/膠原蛋白復(fù)合海綿的產(chǎn)品圖； 圖2為氧化納米纖維素/膠原蛋白復(fù)合海綿的掃描電鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對本 發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋 在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0017]
【具體實(shí)施方式】一：本實(shí)施方式提供了一種膠原蛋白海綿的制備方法，具體按照以 下步驟進(jìn)行： (D取低溫冷凍純凈的牛跟腱，剪碎，放入Na2CO3溶液中浸泡6h、12h、24h，取出晾干后 低溫冷凍保存。
[0018] fg)將5g牛跟腱碎末放入含4g胃蛋白酶的醋酸溶液中。將燒瓶置于4°C恒溫水