一種抗流感病毒的珍珠菜提取物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥提取物領(lǐng)域，具體涉及一種珍珠菜提取物及含有該提取物的藥物 制劑，該提取物可以應(yīng)用于抗流感病毒領(lǐng)域，治療和預(yù)防流行性感冒。
【背景技術(shù)】
[0002] 從天然產(chǎn)物中尋找結(jié)構(gòu)新穎或藥理作用獨(dú)特的生物活性物質(zhì)，并以此為先導(dǎo)化合 物通過(guò)結(jié)構(gòu)改造等方法發(fā)現(xiàn)新藥已是公認(rèn)的新藥研發(fā)的重要手段之一。在1981-2010年 間批準(zhǔn)上市的1073種小分子藥物中，有50%來(lái)源于天然產(chǎn)物或者與天然的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)有關(guān)。 自上世紀(jì)開(kāi)始，許多在臨床上廣泛應(yīng)用的藥物均從天然產(chǎn)物中發(fā)掘出來(lái)，如青蒿素、紫杉醇 等。
[0003] 我國(guó)運(yùn)用天然藥物具有悠久的歷史，并形成了自己獨(dú)特醫(yī)學(xué)理論，很多傳統(tǒng)的中 藥方劑至今還在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出良好的效果。與此同時(shí)，我國(guó)地域廣闊，各地氣象差異懸 殊，天然產(chǎn)物資源豐富，種類繁多，中藥資源更是多達(dá)12000多種。因此，隨著天然藥物愈來(lái) 愈受到重視，從中草藥中提取活性化學(xué)成分，經(jīng)藥理、臨床試驗(yàn)確定其療效，然后制成各種 制劑供臨床使用，已經(jīng)成為我國(guó)加入WT0以后，發(fā)現(xiàn)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)新藥、壯大我國(guó)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè) 的重要手段。
[0004] 珍珠菜LysimachiaclelhroidesDuby為報(bào)春花科珍珠菜屬植物，又名扯根菜，紅 根草等。全草入藥，廣泛分布于華北及長(zhǎng)江以南各省區(qū)，具有清熱解毒、活血調(diào)經(jīng)、利水消腫 等功效，在民間用于治療水腫、熱淋、黃疽、帶下、經(jīng)閉、跌打骨折、乳痛療拖、蛇咬傷等?，F(xiàn)代 科學(xué)研宄證明珍珠菜屬主要化學(xué)成分為黃酮和三萜皂苷，還有苯駢內(nèi)酯、醌類、酚酸、生物 堿、甾體皂苷及木脂素等，主要具有細(xì)胞毒、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種珍珠菜提取物，其制備方法和液相分析方法，含有該 提取物的藥物制劑及利用該提取物制備抗流感病毒藥物的用途。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種珍珠菜提取物，該提取物由以下方法制備：
[0008] (a)將干燥的珍珠菜用70 %乙醇溶液熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味得 到乙醇提取濃縮液；(b)將步驟（a)所得乙醇提取濃縮液用水稀釋，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，減壓濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物；（c)正丁醇萃取物用水溶解，過(guò)濾，用大孔樹(shù)脂富集活性成分，先用15%乙醇沖洗8個(gè) 柱體積除去大極性成分，再用70 %乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮，即得 珍珠菜提取物。
[0009] 進(jìn)一步地，步驟（C)中所述大孔樹(shù)脂為AB-8型大孔樹(shù)脂。
[0010] 為了能夠通過(guò)建立HPLC指紋圖譜的方法控制不同批次制備的提取物的批間差 異，所述提取物的液相分析方法為：
[0011] 色譜柱：AgilentZorbaxSB-C18 柱（4. 6mmX250mm，5ym);
[0012] 流動(dòng)相：A為乙腈，B為0. 4%磷酸溶液；
[0013] 梯度洗脫程序：0? 01 ~lOmin，A10%- 15% ;10 ~30min，A15%-48% ;30 ~ 55min，A48%- 78% ;55 ~65min，A78%- 10% ;
[0014] 流動(dòng)相流速：1.OmL?minS
[0015] 檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm;
[0016] 柱溫：30°C;
[0017] 進(jìn)樣量：10yL。
[0018] 藥物制劑，含有治療有效量的所述提取物和藥學(xué)上可接受的載體。
[0019] 所述的提取物在制備抗流感病毒的藥物中的應(yīng)用。
[0020] 所述的藥物制劑在制備抗流感病毒的藥物中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明提取物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物制劑的形式使用。
[0022] 所述藥物制劑含有治療有效量的本發(fā)明珍珠菜提取物，其余為藥物學(xué)上可接受 的、對(duì)人和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0023] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物制劑以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明提取物可 通過(guò)口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無(wú)菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
[0024] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明通過(guò)對(duì)珍珠菜進(jìn)行提取、除雜、富集處理，能得到具有抗流 感病毒作用的提取物；本發(fā)明提供的液相分析方法可以用于建立該提取物的指紋圖譜，用 于控制不同批次制備的提取物的批間差異。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為珍珠菜提取物HPLC液相圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0027] 實(shí)施例1 :提取物制備
[0028] 藥材來(lái)源：珍珠菜購(gòu)自安徽亳州中藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地河北。
[0029] 主要試劑：食品級(jí)乙醇購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；醫(yī)藥級(jí)AB-8大孔樹(shù)脂購(gòu) 自天津波鴻樹(shù)脂有限公司；乙腈為HPLC級(jí)，購(gòu)于TEDIA;85 %磷酸為HPLC級(jí)，購(gòu)于TEDIA; 色譜用純凈水為哇哈哈純凈水。
[0030] 制備方法：將10kg干燥的珍珠菜用70%乙醇溶液熱回流提取（25LX3次），合 并提取液，濃縮至無(wú)醇味得到乙醇提取濃縮液（2. 5L);將所得乙醇提取濃縮液用水稀釋至 4L，依次用石油醚（4LX3次）、乙酸乙酯（4LX3次）和水飽和的正丁醇（4LX3次）萃取， 減壓濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物258g; (c)正丁醇萃取 物用1. 5L水溶解，醫(yī)用脫脂棉過(guò)濾，用AB-8大孔樹(shù)脂（2kg，柱體積1. 5L)富集活性成分，先 用15 %乙醇沖洗8個(gè)柱體積（12L)除去大極性成分，再用70 %乙醇洗脫10個(gè)柱體積（15L)， 收集70%洗脫液，減壓濃縮，即得珍珠菜提取物123g。
[0031] 實(shí)施例2:液相色譜分析
[0032] 供試品溶液配制：取實(shí)施例1方法制得的提取物5mg至50mL棕色容量瓶中，加 30mL10%乙腈水溶液超聲溶解，冷卻至室溫后，繼續(xù)加10%乙腈水溶液定容。
[0033] 分析方法：
[0034] 高效液相色譜儀：Agilent1260,二元栗；
[0035] 色譜柱：AgilentZorbaxSB-C18 柱（4. 6mmX250mm，5ym);
[0036] 流動(dòng)相：A為乙腈，B為0. 4%磷酸溶液；
[0037] 梯度洗脫程序：0? 01 ~lOmin，A10%- 15% ;10 ~30min，A15%-48% ;30 ~ 55min，A48%- 78% ;55 ~65min，A78%- 10% ;
[0038] 流動(dòng)相流速：1.OmL?minS
[0039] 檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm;
[0040] 柱溫：3(TC;
[0041] 進(jìn)樣量：1〇yL。
[0042] 用制備的10批次的珍珠菜提取物進(jìn)行分析，進(jìn)行色譜峰匹配，結(jié)果1~7號(hào)峰在 10批樣品色譜圖中均出現(xiàn)。因此標(biāo)定7個(gè)峰為共有色譜峰，據(jù)此建立該提取物的HPLC質(zhì)量 控制圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖1。該10批次的珍珠菜提取物藥理活性相似。
[0043] 實(shí)施例3 :提取物藥理試驗(yàn)
[0044] 一、材料與方法
[0045] 1、藥物及試劑：
[0046] 珍珠菜提取物按實(shí)施例1方法制備；病毒唑：浙江亞太藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批 號(hào)：130901。
[0047] 2、動(dòng)物：昆明種小鼠，雌雄各半，體重20~24g，SPF級(jí)，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中 心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：粵監(jiān)證字2013A018。
[0048] 3、病毒株及細(xì)胞：甲型流感病毒、流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株（FM1)，購(gòu)自中國(guó)預(yù) 防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所;MDCK細(xì)胞株，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞室。
[0049] 4、細(xì)胞培養(yǎng)液和維持液：細(xì)胞培養(yǎng)液為含100U/mL的青霉素、100yg/mL的鏈霉素 和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；細(xì)胞維持液除含2%胎牛血清外，其他成分同培養(yǎng)液。
[0050] 5、方法
[0051 ] (1)珍珠菜提取物在體外對(duì)MDCK培養(yǎng)細(xì)胞的毒性試驗(yàn)
[0052] 將珍珠菜提取物母液用細(xì)胞培養(yǎng)液做等比稀釋后，加到已長(zhǎng)成單層MDCK細(xì)胞培 養(yǎng)板中，100yL/孔，每個(gè)稀釋度藥液做4個(gè)復(fù)孔