用于軟骨修復的具有組織誘導性的水凝膠的制備方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于軟骨修復的具有組織誘導性的水凝膠的制備方法
【背景技術(shù)】
[0002]水凝膠的結(jié)構(gòu)和天然軟骨的細胞外基質(zhì)相似，已被廣泛應用于軟骨缺損修復的研究，有望成為軟骨替換材料。然而，水凝膠的機械性能差，難以適應關節(jié)所處的各種力學環(huán)境，限制了其作為軟骨替換材料的應用。最新研究發(fā)現(xiàn)，雙網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)水凝膠具有良好的機械性能，甚至可以使水凝膠的機械性能達到或則超過軟骨的機械性能?，F(xiàn)有的雙網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)水凝膠的制備方法主要是先聚合一種單體網(wǎng)絡，然后再將其放入含第二層網(wǎng)絡單體的溶液中溶脹后聚合第二層單體，從而形成雙網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)水凝膠。然而，這種兩步制備水凝膠的方法增加了材料的制備難度，制備成本高；同時，這種雙網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)水凝膠大都采用不可降解的合成高分子和另外一種合成高分子或天然大分子交聯(lián)而成，存在不可完全降解及細胞/組織親和性不好的問題。
[0003]生物活性因子(如TGF- β、BMPs, IGF等)作為軟骨組織工程的重要組成部分，可用來調(diào)控細胞的分化、誘導和加速軟骨的形成。生物活性因子結(jié)合到水凝膠中可控制細胞的分化和組織的形成，并能增強水凝膠的生物活性。然而，生長因子藥價昂貴、半衰期短、容易變性，直接在水凝膠表面滴加生長因子或用水凝膠直接溶脹含因子的溶液容易產(chǎn)生突釋，還會因為局部過量產(chǎn)生毒性和致癌性。通過水凝膠成分中的基團共價固定因子，可以解決突釋及局部過量毒性問題，但因子的活性會因共價反應受到破壞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于軟骨修復的具有組織誘導性的水凝膠的制備方法。該方法制備的水凝膠具備良好的生物可降解性、細胞/組織親和性，裝載的生長因子活性高，緩釋性能好，能更好的誘導軟骨再生，促進軟骨修復。
[0005]本發(fā)明為實現(xiàn)其發(fā)明目的，所采用的技術(shù)方案是，一種用于軟骨修復的具備組織誘導性的水凝膠的制備方法，其具體步驟如下:
[0006]—種用于軟骨修復的具有組織誘導性的水凝膠的制備方法，其具體步驟如下:
[0007]A、多糖或蛋白的雙鍵化
[0008]將多糖或蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液中得到多糖或蛋白的質(zhì)量濃度為0.5?10%的溶液，然后，向溶液中滴加多糖或蛋白0.16?17.5倍質(zhì)量的甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸，然后在5°C?60°C下，攪拌反應2?24小時；隨后，將溶液稀釋5倍，再進行透析、干燥后得到雙鍵化的多糖或蛋白；
[0009]B、水凝膠的制備
[0010]將甲基丙烯酰胺化多巴胺單體溶于二甲亞砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺單體溶液，再將甲基丙烯酰胺化多巴胺單體溶液和A步得到的雙鍵化的多糖或蛋白共溶于磷酸鹽緩沖溶液中配制成混合液，混合液中雙鍵化的多糖或蛋白的質(zhì)量濃度為0.5-20%，甲基丙烯酰胺多巴胺單體的質(zhì)量濃度為0.5-5%。然后，將光引發(fā)劑加入到混合溶液中，加入的光引發(fā)劑的質(zhì)量濃度為0.05?0.5% ;再用波長為365nm、強度為2?lOmw/cm2的紫外光，對混合液照射5?15分鐘，引發(fā)溶液聚合形成水凝膠；
[0011]C、生長因子的吸附
[0012]用磷酸鹽緩沖溶液、氯化鈉溶液或水對水凝膠進行清洗，再用體積濃度為50?99%的乙醇溶液對水凝膠進行脫水；清洗、脫水的操作進行3次；然后將水凝膠轉(zhuǎn)移到生長因子濃度為0.02?0.2 μ g/ml的磷酸鹽緩沖溶液、氯化鈉溶液或水中，溶脹后即得。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0014]—、A步中的天然高分子的多糖/蛋白通過甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸進行改性后，使其側(cè)鏈帶有雙鍵基團，使原本難以聚合的多糖或蛋白能夠聚合形成水凝膠。B步中，側(cè)鏈帶有雙鍵基團的多糖/蛋白再與側(cè)鏈帶有雙鍵的甲基丙烯酰胺化多巴胺通過側(cè)鏈的雙鍵進行自由基聚合生成碳碳共價鍵第一網(wǎng)絡；同時，甲基丙烯酰胺化多巴胺的酚羥基和多糖或蛋白側(cè)鏈上的氨基、羥基或羧基通過氫鍵作用形成第二網(wǎng)絡，從而使最終制的水凝膠具備雙網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，力學性能好。并且多巴胺的自粘附性還使水凝膠具備自愈合能力，抵抗破壞的能力強，能更好的滿足受損軟骨修復的需要。
[0015]二、碳碳共價形成的第一網(wǎng)絡，氫鍵作用形成的第二網(wǎng)絡，在同一液相環(huán)境中一步形成。雙網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)水凝膠一步制備形成，較之于兩步法，其制備簡便、快捷，成本低，且能更精確的控制水凝膠中各組分的比例。
[0016]三、形成水凝膠的主體成分是具有優(yōu)異的細胞/組織親和性的多巴胺和天然高分子的多糖或蛋白，且三種物質(zhì)均可以完全生物降解。因此，本發(fā)明制備的水凝膠能夠完全生物降解，且細胞/組織親和性好，有利于軟骨組織的生長和修復。
[0017]四、雙網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)水凝膠中的多巴胺上的酚羥基在C步的液相環(huán)境中與生長因子中的氨基或巰基結(jié)合，將因子負載在水凝膠中。這種非共價固定因子的方式既能很好的將生長因子固定在水凝膠上，既解決突釋及局部過量毒性問題，同時也避免了生長因子會因共價反應受到的破壞，其活性保持良好，能更好的誘導軟骨組織的生長與修復。
[0018]進一步，本發(fā)明A步中的多糖是殼聚糖，硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸，蛋白是明膠。
[0019]這幾種天然多糖/蛋白都能與甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸通過適當?shù)姆磻獥l件而在其側(cè)鏈上接枝上雙鍵。然后，通過自由基聚合反應使帶雙鍵的多糖/蛋白交聯(lián)，從而形成一層共價交聯(lián)網(wǎng)絡。
[0020]進一步，本發(fā)明的A步中的多糖是海藻酸鈉，蛋白是膠原；在加入甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸的同時，還加入HXVNHS。
[0021]進一步，本發(fā)明的B 步中的光引發(fā)劑是 irgacure2959，irgacurel84，irgacurel27或 irgacure500o
[0022]進一步，本發(fā)明的C步中的生長因子是轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β 1、TGF-13 2、或TGF-β 3。
[0023]進一步，本發(fā)明的C步中的生長因子是骨形態(tài)發(fā)生蛋白ΒΜΡ-2或ΒΜΡ-7。
[0024]進一步，本發(fā)明的C步中的生長因子是胰島素生長因子IGF-1或IGF-1I。
[0025]上述的轉(zhuǎn)化生長因子和胰島素生長因子具有良好軟骨誘導功能，骨形態(tài)發(fā)生蛋白能夠誘導動物或人體間充質(zhì)細胞分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經(jīng)組織。
【具體實施方式】
[0026]實施例1
[0027]A、明膠的雙鍵化
[0028]將明膠溶于磷酸鹽緩沖溶液中得到明膠的質(zhì)量濃度為10%的溶液，然后，向溶液中滴加明膠0.8倍質(zhì)量的甲基丙烯酸酐，然后在50°C下，攪拌反應3小時；隨后，將溶液稀釋5倍，再進行透析、干燥后得到雙鍵化的明膠；
[0029]B、水凝膠的制備
[0030]將甲基丙烯酰胺化多巴胺單體溶于二甲亞砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺單體溶液，再將甲基丙烯酰胺化多巴胺單體溶液和A步得到的雙鍵化的明膠共溶于磷酸鹽緩沖溶液中配制成混合液，混合液中雙鍵化的明膠的質(zhì)量濃度為20%，甲基丙烯酰胺多巴胺單體的質(zhì)量濃度為4%。然后，將光引發(fā)劑irgacure2959加入到混合溶液中，加入的光引發(fā)劑的質(zhì)量濃度為0.05% ;再用波長為365nm、強度為lOmw/cm2的紫外光，對混合液照射5分鐘，引發(fā)溶液聚合形成水凝膠；
[0031]C、生長因子的吸附
[0032]用磷酸鹽緩沖溶液對水凝膠進行清洗，再用體積濃度為99%的乙醇溶液對水凝膠進行脫水；清洗、脫水的操作進行3次；然后將水凝膠轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I濃度為0.2 μ g/ml的磷酸鹽緩沖溶液中，溶脹后即得。
[0033]實施例2
[0034]A、明膠的雙鍵化
[0035]將明膠溶于磷酸鹽緩沖溶液中得到明膠的質(zhì)量濃度為10 %的溶液，然后，向溶液中滴加明膠17.5倍質(zhì)量的甲基丙烯酸縮水甘油酯，然后在50°C下，攪拌反應3小時；隨后，將溶液稀釋5倍，再進行透析、干燥后得到雙鍵化的明膠；
[0036]B、水凝膠的制備
[0037]將甲基丙烯酰胺化多巴胺單體溶于二甲亞砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺單體溶液，再將甲基丙烯酰胺化多巴胺單體溶液和A步得到的雙鍵化的明膠共溶于磷酸鹽緩沖溶液中配制成混合液，混合液中雙鍵化的明膠的質(zhì)量濃度為15%，甲基丙烯酰胺單體的質(zhì)量濃度為3%。，將光引發(fā)劑irgacurel27加入到混合溶液中，加入的光引發(fā)劑的質(zhì)量濃度為0.1% ;再用波長為365nm、強度為5mW/cm2的紫外光，對混合液照射10分鐘，引發(fā)溶液聚合形成水凝膠；
[0038]C、生長因子的吸附
[0039]用磷酸鹽緩沖溶液對水凝膠進行清洗，再用體積濃度為75%的乙醇溶液對水凝膠進行脫水；清洗、脫水的操作進行3次；然后將水凝膠轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β 3濃度為0.02 μ g/ml的磷酸鹽緩沖溶液中，溶脹后即得。
[0040]實施例3
[0041]A、明膠的雙鍵化
[0042]將明膠溶于磷酸鹽緩沖溶液中得到明膠的質(zhì)量濃度為10%的溶液，然后，向溶液中滴加明膠0.16倍質(zhì)量的甲基丙烯酸縮水甘油酯，然后在50°C下，攪拌反應3小時；隨后，將溶液稀釋5倍，再進行透析、干燥后得到雙鍵化的明膠；
[0043]B、水凝膠的制備
[0044]將甲基丙烯酰胺化多巴胺單體溶于二甲亞砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺單體