bFGF優(yōu)化的促進(jìn)硬組織再生的ADM屏障膜及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種bFGF優(yōu)化的促進(jìn)硬組織再生 的ADM屏障膜及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 先天畸形、外傷及腫瘤等引起的各種骨缺損嚴(yán)重困擾著廣大患者及醫(yī)療工作者， 牙周炎引起的骨喪失一直是妨礙牙周醫(yī)學(xué)發(fā)展的主要瓶頸。近年來，骨組織工程作為一門 新興的交叉學(xué)科為骨缺損的修復(fù)帶來了新的希望。其中，引導(dǎo)組織再生（GTR)屏障膜具有 細(xì)胞阻隔和維持引導(dǎo)特定組織再生空間的功能而成為GTR不可缺少的一個組成部分，理想 的屏障膜材料應(yīng)該具有良好的生物相容性、生物可吸收性及合適的機(jī)械和物理特性，并能 夠促進(jìn)細(xì)胞間的交流及組織再生。大概可分為可吸收性膜和不可吸收性膜，其中，第一代屏 障膜是不可吸收性膜，需要二次手術(shù)取出，增加患者痛苦；第二代生物膜是可吸收性膜，以 膠原膜和殼聚糖膜為代表，已在臨床上廣泛應(yīng)用；目前技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到第三代生物膜，不僅 要求GTR膜作為屏障，而且希望其能作為載體釋放藥物，如抗炎藥，生長因子，粘附因子等 促進(jìn)缺損區(qū)域的愈合。已有研究發(fā)現(xiàn)堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF)是一種可促進(jìn)骨髓 基質(zhì)細(xì)胞生長和增殖的重要因子，bFGF及其制劑的相關(guān)應(yīng)用研究一直是組織工程材料、再 生醫(yī)學(xué)及創(chuàng)傷治療領(lǐng)域最活躍的課題之一。但是，bFGF作為一種堿性多肽，對熱和酸敏感、 易被蛋白酶分解、在體內(nèi)半衰期短，因此其生物學(xué)效應(yīng)不能得到充分發(fā)揮.如何有效地發(fā) 揮bFGF的生物學(xué)效應(yīng)制約著bFGF的進(jìn)一步體內(nèi)應(yīng)用研究，目前解決這一問題的方法大都 采用微球緩釋系統(tǒng)，但緩釋微球的制備工序繁瑣，需要經(jīng)過交聯(lián)，乳化，磁力攪拌，洗滌，過 濾凍干等多個步驟，平均時長約為125小時，耗時，費(fèi)力，成本高。
[0003] 脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（acelluar dermal matrix, ADM)是一種被去除細(xì)胞結(jié)構(gòu)的天然 細(xì)胞外基質(zhì)，具有天然細(xì)胞外基質(zhì)的基本成分和三維結(jié)構(gòu)，膠原網(wǎng)架是其基本結(jié)構(gòu)。目前關(guān) 于ADM膜的研究主要集中于引導(dǎo)組織再生的屏障膜及軟組織再生中，臨床應(yīng)用以煙臺正海 生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的海奧膜（^^&丨-,\丨出）為主要商品，效果佳，該種商品化的膜材料分 為兩面：基質(zhì)面和真皮面，其中，基質(zhì)面粗糙，可幫助細(xì)胞粘附、生長和增殖，調(diào)控細(xì)胞分化； 真皮為光滑面，有效減少纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞向缺損區(qū)迀移和伸展，為缺損區(qū)骨再生提供一 定的空間。但基于該屏障膜的研究基本很少涉及骨組織工程，且未發(fā)現(xiàn)負(fù)載生長因子的ADM 膜，這體現(xiàn)了 ADM膜材料領(lǐng)域的一大空白，也制約了 ADM膜在硬組織再生領(lǐng)域的大范圍應(yīng) 用。
[0004] 1996 年，F(xiàn)aham 等發(fā)現(xiàn)了 bFGF 的肝素結(jié)合位點(diǎn)（Faham S ;Hileman RE ;Fromm JR Heparin structure and interactions with basic fibroblast growth factor. Science. 1996 Feb 23 ;271 (5252) :1116-2.)，且低濃度的外源肝素（0.1-30nmol/L)可 以促進(jìn)bFGF與受體結(jié)合。體外試驗發(fā)現(xiàn)，與肝素結(jié)合可以增強(qiáng)bFGF對酸、熱及蛋白酶 降解的抵抗能力。體內(nèi)試驗證明，在果蠅發(fā)育過程中，對于bFGF正常發(fā)揮其調(diào)控作用來 說，硫酸肝素是必不可少的物質(zhì)（Ornita DM. FGFs, heparin sulfate and FGFRs:complex interactions essential for development. Bioessays. 2000 Feb ;22 (2) : 108-12. ) 〇 目前 雖有學(xué)者證明肝素可有效結(jié)合bFGF并使其生物活性得以更好的發(fā)揮，但未有報道將該項 技術(shù)應(yīng)用于改良引導(dǎo)組織再生屏障生物膜。
[0005] 專利CN 103656751 A公開了一種bFGF-ADM復(fù)合體，應(yīng)用于創(chuàng)面、肉芽創(chuàng)面和慢性 潰瘍及褥瘡的覆蓋，起到防止水分蒸發(fā)、蛋白質(zhì)和熱量流失，預(yù)防微生物感染，促進(jìn)創(chuàng)面愈 合的作用，該專利運(yùn)用靜電吸附的方法將bFGF負(fù)載于ADM表面，吸附能力弱，緩釋效果不明 顯，并且該復(fù)合體僅限于軟組織修復(fù)，未有報道可應(yīng)用于骨組織工程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一種bFGF優(yōu)化的促進(jìn)硬組織再生的 ADM屏障膜及其制備方法與應(yīng)用。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種bFGF優(yōu)化的ADM屏障膜，步驟為：（1)將ADM膜置于含有肝素的MES生物緩 沖液中浸泡后，除去浮于表層的肝素分子獲得肝素化ADM膜；
[0009] (2)將步驟⑴得到的肝素化ADM膜置于bFGF溶液中浸泡后，凍干膜材料，即得到 bFGF優(yōu)化的ADM屏障膜。
[0010] 所述ADM膜為單面膜，即基質(zhì)面和真皮面；或雙面膜，即雙面均為基質(zhì)面。
[0011] 上述bFGF優(yōu)化的ADM屏障膜的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)肝素化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)膜的制備：將ADM膜置于含有肝素的MES生物緩沖液 中浸泡后，除去浮于表層的肝素分子，獲得肝素化ADM膜；
[0013] 具體步驟為：將ADM膜置于含有0. 5-1. 5mmol/L肝素的MES生物緩沖液（0.1mol/ L，pH = 5-5. 5)中，浸泡3-5小時后置于不含肝素的MES生物緩沖液（0· lmol/L，pH = 5-5.5)中12-18h，以洗去浮于表層的肝素分子，獲得肝素化ADM膜。MES生物緩沖液 (0. lmol/L，pH = 5-5. 5)優(yōu)點(diǎn)：含有EDC，可以激活肝素分子的羧基或磺胺基與材料表面的 氨基或羧基進(jìn)行反應(yīng)，實現(xiàn)肝素分子與材料的共價結(jié)合。
[0014] (2)負(fù)載bFGF的肝素化ADM膜制備：將步驟⑴得到的肝素化ADM膜用bFGF溶液 于〇-8°C (優(yōu)選4°C )浸泡后凍干（優(yōu)選_60°C )膜材料，得到負(fù)載bFGF的肝素化ADM膜。 優(yōu)點(diǎn)：4°C條件下浸泡過夜有利于bFGF因子與肝素分子的吸附，使因子充分深入膜材料纖 維結(jié)構(gòu)的空隙中，另外可保存因子的生物活性；_60°C條件下凍干可有效保存因子的活性。
[0015] 所述肝素化ADM膜與bFGF溶液的用量關(guān)系：lcm2:500 μ L。
[0016] 所述 bFGF 溶液為：200ng/mLbFGF，0· I % BSA, 5 % 蔗糖，0· 01 % EDTA 溶于 pH = 7-7. 5的PBS緩沖液。
[0017] 每張 Icm2大小的膜含有IOOng bFGF。
[0018] 上述的bFGF優(yōu)化的ADM膜在制備骨組織工程中所用到的材料中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 本發(fā)明將bFGF負(fù)載于GTR屏障膜材料表面不僅可有效發(fā)揮其空間保持功能而且 可以通過對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的募集和促增殖作用加速大鼠顱骨缺損的愈合，因此該發(fā)明 更新了現(xiàn)有的ADM膜材料，促進(jìn)了骨組織工程的發(fā)展。
[0021] 目前有關(guān)將因子負(fù)載于膜上的技術(shù)中，其他研究者一般采用靜電紡絲技術(shù)，該技 術(shù)對肝素或因子溶液的濃度、粘度、液體的流量等要求比較嚴(yán)格，不易操作，且容易產(chǎn)生負(fù) 載不均勻的現(xiàn)象，并對脫細(xì)胞真皮基質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)有破壞；也有研究者采用化學(xué)接枝的方 法實現(xiàn)肝素與bFGF因子的結(jié)合，該方法的結(jié)合能力受因子濃度、環(huán)境溫度等影響較大，效 率低，產(chǎn)生大量的因子浪費(fèi)。本發(fā)明中采用的bFGF與肝素/硫酸肝素及ADM膜材料的結(jié)合 工藝簡單，按照一定比例混合后僅需一步真空凍干技術(shù)即可達(dá)到目的。
[0022] 本發(fā)明采用真空凍干技術(shù)和肝素化方法使bFGF物理性與化學(xué)性吸附于ADM膜表 面，bFGF的吸附能力強(qiáng)，緩釋效果好。
[0023] 本發(fā)明選取的ADM膜是商品化的海奧膜（Hcal-ΑΙΠ ?)，.無需自己加工，保證其結(jié) 構(gòu)、功能的統(tǒng)一。
[0024] 本發(fā)明制備的膜突破了軟組織修復(fù)的范圍，成功應(yīng)用于骨組織工程，有效促進(jìn)骨 缺損愈合和骨組織再生。
[0025] 本發(fā)明的膜載藥前后的ADM膜材料未有明顯變化如圖1。
[0026] 肝素化膜材料可有效達(dá)到緩釋bFGF的目的。體外緩釋實驗表明未經(jīng)肝素化的ADM 膜負(fù)載bFGF突釋效應(yīng)明顯，48h內(nèi)可釋放載藥量的70%左右，72h可釋放載藥量的80%左 右，后期有少量釋放，但變化不大；而利用肝素化的ADM膜可推遲其突釋時間，達(dá)到有效平 穩(wěn)釋放因子，1周內(nèi)均有明顯釋藥量的增加，10天后趨于穩(wěn)定，基本無新藥釋放。
[0027] 利用肝素化膜材料節(jié)約時間，節(jié)約成本。負(fù)載bFGF的肝素化ADM膜制備僅耗時約 48小時，基本不涉及復(fù)雜工藝，不涉及技術(shù)人員培訓(xùn)等工作，其中使用的原料包括：bFGF生 長因子（60RMB/ μ g)、肝素（44RMB/g)、BSA(3RMB/g)、蔗糖（0· 15RMB/g)、EDTA(0. 5RMB/g)， 價格低廉，降低生產(chǎn)成本。
[0028] 將肝素化的bFGF首次負(fù)載于ADM膜材料表面，應(yīng)用于骨組織再生，效果顯著。
[0029] 為骨組織工程提供一種新的安全有效、價格易于接受和推廣應(yīng)用的新型膜材料。
[0030] 提供一種負(fù)載因子的膜材料的制備方法，方便，可操作性強(qiáng)，所制備的膜材料性能 穩(wěn)定，有良好的生物安全性。
[0031] 本發(fā)明的方法相較于其他方法制備的屏障膜，bFGF的吸附能力強(qiáng)，緩釋效果更好。
[0032] EDTA、蔗