骨生物特異性試劑的制作方法
【專利說明】骨生物特異性試劑
[0001] 本發(fā)明涉及用于骨的生物特異性試劑,特別是骨生物特異性試劑,其包括骨特異 性肽所官能化的納米粒子、亞微米粒子、原子或分子元素。本發(fā)明特別關(guān)注將這些骨生物特 異性試劑應(yīng)用于診斷成像技術(shù),如磁共振成像(MRI)和計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT),應(yīng)用于骨重 塑活動(dòng)的成像、檢測和治療病理性骨疾病和/或骨修復(fù)過程。本發(fā)明使用生物特異性試劑 拓展了骨疾病以及骨病理學(xué)的診斷和/或治療。
[0002] 磁共振成像(MRI)和計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)是組織成像的所選的方法。磁共振成 像基于高強(qiáng)度磁場,產(chǎn)生一個(gè)凈磁矢量暫時(shí)改變高度水和組織中的質(zhì)子的取向。磁共振成 像主要適用于韌帶、肌腱及脊髓的損傷和腦部腫瘤的成像。然而,此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于骨組織成 像時(shí),并不能獲得如同計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)成像一般的細(xì)節(jié)圖像。
[0003] 計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)是基于X射線衰減原理,利用檢測器檢測X射線衰減,并計(jì) 算像素的值,然后將其轉(zhuǎn)化為圖像。定量計(jì)算機(jī)斷層掃描(QCT)能夠提供骨密度測量,相對(duì) 于二維的骨密度面積能夠檢測三個(gè)維度的真實(shí)體積(毫克/立方厘米)。這使得操作員能 夠區(qū)分皮質(zhì)和松質(zhì)骨,并且能夠準(zhǔn)確地確定骨隨時(shí)間推移的變化。因此,定量CT主要用來 進(jìn)行椎體松質(zhì)骨密度檢查,定量CT可以選擇性地評(píng)估具有代謝活性和結(jié)構(gòu)上十分重要的 骨小梁,并且能夠區(qū)分椎骨破裂,測量骨質(zhì)損失。然而,定量CT非常昂貴,而且相對(duì)于雙能 X線吸收測定法,定量CT使得患者暴露于高劑量的電離輻射。
[0004] 對(duì)于磁共振成像和計(jì)算斷層掃描而言,造影劑是改善成像技術(shù)中不可缺少的,因 為它們提高了圖像的清晰度。目前在磁共振成像中使用的造影劑對(duì)組織沒有特異性,這些 造影劑是基于鐵氧化物納米顆?;蛘哚彙H欢?,雖然現(xiàn)在使用的造影劑能夠提供良好的成 像效果,對(duì)患者是安全的,但是這些造影劑是無法識(shí)別特定的組織和細(xì)胞類型。此外,目前 CT所使用的造影劑,如基于碘的化合物有幾個(gè)局限性,包括由于快速腎清除引起的成像時(shí) 間較短,同時(shí)導(dǎo)致腎毒性,血管滲透。
[0005] 盡管骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制目前還不清楚,數(shù)據(jù)表明,它是由破骨細(xì)胞的骨吸 收活動(dòng)和成骨細(xì)胞的骨形成活動(dòng)之間的不平衡所造成的。這種不平衡的細(xì)胞活動(dòng)導(dǎo)致 骨組織的漸進(jìn)性弱化,最終導(dǎo)致形成微骨折,微骨折是在臨床顯著的骨折的起始點(diǎn)。流 行病學(xué)的研究表明,這些微骨折往往在特定的解剖部位發(fā)生,包括椎體,股骨轉(zhuǎn)子下 (sub-throcanteric femoural bone)和手腕。盡管不平衡細(xì)胞活動(dòng)在大多數(shù)骨質(zhì)疏松癥 病例中起關(guān)鍵作用,其中骨質(zhì)流失(即骨質(zhì)疏松)的相對(duì)貢獻(xiàn)可能有所不同,這取決于許多 不同的因素,包括年齡,性別,遺傳易感性骨質(zhì)疏松,缺乏鍛煉,藥物,健康和營養(yǎng)。一般情況 下,骨質(zhì)疏松癥被歸類為原發(fā)性(即老年期)或繼發(fā)性(即非年齡相關(guān))。
[0006] 原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥可以進(jìn)一步分為I型(即絕經(jīng)后)或II型(即年齡相關(guān)型)。 I型骨質(zhì)疏松癥主要發(fā)生在50歲至70歲人群,主要是由于絕經(jīng)后的雌激素?fù)p失及其對(duì)骨 小梁的影響。II型與衰老過程密切相關(guān),通常發(fā)生在70歲及以上人群,衰老影響骨小梁和 皮質(zhì)骨。然而,眾所周知,骨密度的變化在每個(gè)人身上都發(fā)生,與年齡無關(guān)。在正常的成長 期,骨形成比骨質(zhì)流失更快,直到30-35歲時(shí)達(dá)到骨質(zhì)峰值(PBM)。一旦達(dá)到骨質(zhì)峰值,男性 和女性都開始發(fā)生骨質(zhì)流失,其流失率范圍在〇. 5-2%每年,取決于個(gè)體差異。在女性中,更 年期進(jìn)一步加速骨質(zhì)流失率,時(shí)間段約為10年。
[0007] 繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是由一種隱形的醫(yī)療疾病或生活方式(如飲酒、藥物濫用或不 良飲食)引起的并發(fā)癥,并可能影響到所有年齡段的人。事實(shí)上,已經(jīng)有報(bào)道表明年齡僅僅 在幾周齡的嬰兒,其骨密度低于預(yù)期值,會(huì)發(fā)展為骨質(zhì)疏松癥。可以引起繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥 的醫(yī)療疾病包括激素失衡,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,肝衰竭,腎衰竭疾病,胃腸功能受損,多發(fā)性硬 化癥,壞血病,神經(jīng)性厭食癥和運(yùn)動(dòng)員三聯(lián)癥。在某些情況下,醫(yī)療疾病并不導(dǎo)致骨質(zhì)疏松 癥的條件,但治療所使用的藥物能夠?qū)е鹿琴|(zhì)疏松癥。一些用來進(jìn)行治療醫(yī)療疾病的藥物, 如皮質(zhì)類固醇,一些激素和鋰,與繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展有關(guān)。一般而言,骨質(zhì)疏松癥在 女性比男性多發(fā)具有更多的臨床顯著性。
[0008] 骨肉瘤是最常見的原發(fā)性肉瘤(其發(fā)生率為:0.2-3/每100 000人/年),是成 骨細(xì)胞分化導(dǎo)致類骨質(zhì)組織不良或骨生長不良,從而影響骨完整性。盡管骨肉瘤也能夠發(fā) 展為惡性骨肉瘤,其在惡性腫瘤中的絕對(duì)發(fā)病率低。在嚴(yán)格的組織學(xué)定義中,骨肉瘤病變?cè)?組織學(xué)特征上是多樣化的,其預(yù)后不僅取決于這些參數(shù),還依賴于骨肉瘤的解剖學(xué)部位。骨 肉瘤的另一個(gè)特點(diǎn)是有產(chǎn)生不同數(shù)量軟骨基質(zhì)和纖維組織的趨勢(shì),在某些情況下,主導(dǎo)了 實(shí)質(zhì)的骨質(zhì)形成。因此,形成三個(gè)亞型的分類,即成骨細(xì)胞型骨肉瘤,軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤 和成纖維細(xì)胞型骨肉瘤。在骨骼系統(tǒng)內(nèi)部,骨肉瘤通常發(fā)生在四肢骨的干骨后端,在成人中 觀察到,骨肉瘤最通常的是在膝關(guān)節(jié)周圍,以及在軸向骨架或顱面骨周圍。就骨而言,骨肉 瘤可能發(fā)生在骨內(nèi)(髓內(nèi)或皮層內(nèi)室),骨的表面,以及骨外位點(diǎn)。
[0009] 骨轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)是成骨性表型,溶骨性表型,或者同時(shí)具備成骨性和溶骨性表型。不 同的惡性腫瘤表現(xiàn)出促骨效應(yīng)和骨高親和力,癌癥最常見的轉(zhuǎn)移沉積在骨中。常見的惡性 腫瘤,包括乳腺癌,前列腺癌和肺癌最終轉(zhuǎn)移為骨癌。因此,骨癌被廣泛認(rèn)為是腫瘤領(lǐng)域的 一個(gè)重大挑戰(zhàn)。一旦轉(zhuǎn)移至骨,轉(zhuǎn)移細(xì)胞增加成骨細(xì)胞的增殖和活性,包括通過釋放可溶性 介質(zhì)或通過細(xì)胞與細(xì)胞的接觸來增加核因子-K B受體活化因子配基(RANKL)的表達(dá)和其 釋放。這將通過RANKL-核因子-K B受體活化因子配基(RANK)之間的相互作用激活破骨 細(xì)胞前體的分化和成熟破骨細(xì)胞的活性。破骨細(xì)胞的骨吸收所釋放的細(xì)胞因子和其他生長 因子如TGF-0和胰島素樣生長因子(IGF)對(duì)腫瘤細(xì)胞是必需的,從而提高腫瘤的生長和延 續(xù)的過程。骨吸收增加所留下的溶骨性病變可以通過X射線、密度掃描技術(shù)和磁共振成像 進(jìn)行檢測。成骨細(xì)胞異常轉(zhuǎn)移所增加的骨形成,在骨中表現(xiàn)為高密度區(qū),可以通過X-射線 和磁共振成像(MRI)觀測。
[0010] 健康和病變的骨之間的骨吸收活化的頻率的差異大于骨吸收和形成階段之間的 差異。骨激活頻率是由骨表面的所謂的多發(fā)性骨細(xì)胞單元(BMU)的量所表征。多發(fā)性骨細(xì) 胞單元在骨質(zhì)疏松的骨表面的含量大于正常骨表面的含量,而且其含量與骨中破骨細(xì)胞含 量及骨吸收陷窩的增加相關(guān)。在系統(tǒng)性疾病如骨質(zhì)疏松癥中的骨穿刺組織學(xué)染色,可能被 用來作為診斷方法,而且染色會(huì)使人們有可能觀察到用于診斷和治療的微觀定位的固體顆 粒材料(比如普魯士藍(lán)染色鐵離子)。
[0011] 根據(jù)上述觀點(diǎn),認(rèn)為提供新的手段來診斷和/或治療骨相關(guān)疾病的需求將越來越 多。
[0012] 因此,根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面,是提供了一種骨生物特異性試劑,其包括造影劑 核心,此造影劑核心是可以被磁共振成像(MRI)或計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)觀測到;造影劑核 心被一個(gè)聚合物殼所包圍,這個(gè)聚合物殼起到官能化骨靶向肽的作用,其中所使用到的肽 是具有骨生物學(xué)特異性的。
[0013] 本發(fā)明中的骨生物特異性試劑的發(fā)明是基于設(shè)計(jì),開發(fā)和完善一系列不同的納米 粒子,亞微米粒子和原子或分子的元素,以及它們?cè)诖殴舱癯上瘢∕RI)和計(jì)算機(jī)斷層掃描 (CT)成像技術(shù)中的應(yīng)用,這將在下面詳細(xì)描述。骨生物特異性試劑包括核心,此核心包括已 經(jīng)被能夠特異性地識(shí)別骨細(xì)胞(如成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞)或礦化骨細(xì)胞外基質(zhì)(如羥基磷 灰石)的肽官能化的常規(guī)造影劑。因此,所述肽使所述試劑對(duì)骨病理學(xué)具有特異性生物識(shí) 另IJ。如實(shí)施例1-3中所描述和圖5E所示,發(fā)明人已經(jīng)準(zhǔn)備了一系列不同的骨特異性試劑, 其中一定范圍的不同骨靶向肽將被用于官能化聚合物殼。仔細(xì)選擇用于造影劑核心的材 料,形成聚合物殼的聚合物,和骨特異性的官能化肽,使得骨生物特異性試劑能夠用于診斷 和/或治療各種骨相關(guān)疾病。因此,生物特異性試劑可用于骨重塑活動(dòng)的成像、檢測病理情 況(如骨吸收或骨腫瘤)和或/骨折或手術(shù)干預(yù)后的組織修復(fù)過程。更為有利的是,發(fā)明 的生物特異性試劑已經(jīng)被設(shè)計(jì)為骨重建過程中必不可少的與疾病骨特異性相互作用的必 要元素,同時(shí)可以精心定制用于更少入侵性早期診斷和/或治療骨疾病的可注射材料。 [0014] 優(yōu)選地,造影劑形成或組成為本發(fā)明生物特異性試劑的核心,其由外層的聚合物 殼包圍。造影劑核心的平均直徑可為5nm和30nm之間,或在IOnm和20nm之間。
[0015] 在使用磁共振成像或計(jì)算機(jī)斷層掃描中可見的造影劑核心可以包含金屬或非金 屬材料。造影劑核心可以包括磁性或非磁性材料。在造影劑是磁性的實(shí)施方式中,它可以 包括磁共振成像造影劑。造影劑可以包括順磁性或超順磁性材料。例如,造影劑核心可能 包括鐵、鎳、鈷或鏑,或化合物,如氧化物或合金,其中包含一種或多種的這些元素。優(yōu)選地, 所述造影劑包括磁鐵礦(Fe 3O4)。
[0016] 在所述的造影劑是非磁性的實(shí)施方式中,它可能包括磁共振成像(MRI)和計(jì)算機(jī) 斷層掃描(CT)的造影劑。例如,造影劑核心可能包括釓、金、碘或硼硫酸。這些材料中的每 一種都可以用作磁共振成像或計(jì)算機(jī)斷層掃描的造影劑。優(yōu)選地,所述造影劑包括釓。
[0017] 骨生物特異性試劑的聚合物殼可以包含聚合物,該聚合物可以包括多肽、帶電荷 的蛋白質(zhì)、多糖和核酸。合適的聚合物可以包括任何生物相容性的天然的或合成的聚合物, 包括但不限于,殼聚糖,膠原,明膠,透明質(zhì)酸,聚(乙二醇)聚(乳酸),聚(乙醇酸),聚 (e _己內(nèi)酯)和聚(丙烯酸)。優(yōu)選的用于聚合物殼的聚合物可以包括殼聚糖。殼聚糖是 一種已知的線性多糖,其含有隨機(jī)分布的(6-(1-4)連接的D-氨基葡萄糖(去乙?;瘑卧?和N-乙酰-D-氨基葡萄糖(乙?;瘑卧?br>[0018] 所述聚合物殼通過物理吸附或共價(jià)鍵連接到造影劑核心,連接方式取決于聚合物 的化學(xué)性質(zhì)和造影劑核心的表面的化學(xué)性質(zhì)。聚合物殼可以進(jìn)一步設(shè)計(jì)衍生物以達(dá)到有 效地骨靶向肽的官能化是符合需要的。例如,聚合物殼可以通過聚合物與琥珀酸酐反應(yīng)進(jìn) 衍生。這樣可以提供聚合物和骨靶向肽之間的空間,以減少空間位阻。它也可以提高所使 用的聚合物(如殼聚糖)的溶解性和生理pH。琥珀酸酐又名二氫-2, 5-呋喃二酮,分子式 C4H4O3??梢杂社晁狒磻?yīng)得到聚合物的衍生物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的,例如 殼聚糖,這些將在實(shí)施例1中描述。
[0019] 能夠連接到的聚合物殼上的骨靶向肽的量取決于官能團(tuán)的量,所使用的聚合物的 類型和連接的化學(xué)性質(zhì)。優(yōu)選地,肽以間隔陣列布置包被在聚合物殼的外表面。聚合物殼 可被一種(即相同的序列)骨靶向肽所官能化,后者將生物特異性試劑導(dǎo)向骨。然而,聚合 物殼可被兩種或兩種以上(即具有不同的序列)的骨靶向肽所官能化。
[0020] 例如,骨靶向肽可以將生物特異性試劑導(dǎo)向至骨中存在的細(xì)胞,例如成骨細(xì)胞,骨 細(xì)胞,破骨細(xì)胞,骨細(xì)胞祖細(xì)胞,破骨細(xì)胞祖細(xì)胞或骨襯里細(xì)胞。優(yōu)選地,骨靶向肽將生物特 異性試劑導(dǎo)向成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。具有能夠模仿GAP-連接通訊(例如連接蛋白43,Cx43) 的肽也可以作為骨靶向肽,GAP-連接通訊特異性于幀間和幀內(nèi)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的細(xì) 胞通訊。此外,骨靶向肽可以將生物特異性試劑導(dǎo)至骨的骨礦物相,即羥基磷灰石。因而, 包括羥基磷灰石靶向肽的生物特異性試劑可以作為一個(gè)有價(jià)值的工具,用來監(jiān)測骨組織創(chuàng) 傷或疾病進(jìn)展(如骨質(zhì)疏松癥)過程中的形成骨組織的礦化作用。
[0021] 眾所周知,許多人骨疾病與骨重建循環(huán)失調(diào)有關(guān),如佩吉特氏病,和癌癥骨轉(zhuǎn) 移,預(yù)示了護(hù)骨素(osteoprogeterinMOPG)和RANKL之間的不平衡。發(fā)明者由此相信 RANK-RANKL-0PG途徑及其相關(guān)途徑可能被用于開發(fā)