一種將白藜蘆醇和二甲雙胍組合用于抗腫瘤藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種將白藜蘆醇和二甲雙胍組合用于抗腫瘤藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]胰腺具有內(nèi)分泌和外分泌兩種功能，也就有內(nèi)分泌和外分泌兩種細(xì)胞。這兩種細(xì)胞都會(huì)發(fā)生癌變，來(lái)源自?xún)?nèi)分泌細(xì)胞的癌叫內(nèi)分泌癌，來(lái)自外分泌細(xì)胞的癌叫外分泌癌，二者惡性程度差異很大。內(nèi)分泌癌約占4%，臨床上比較少見(jiàn)，惡性程度不高，這類(lèi)患者術(shù)后存活時(shí)間較長(zhǎng)。而來(lái)自外分泌細(xì)胞的外分泌癌約占96%，而且臨床上90-95%的外分泌癌是導(dǎo)管細(xì)胞來(lái)源的胰腺癌，也就是人們通常所說(shuō)的胰腺癌，“導(dǎo)管胰腺癌”惡性程度極高。醫(yī)學(xué)的發(fā)展使很多癌癥已有了較好的治療效果，遺憾的是，胰腺癌恰恰是人們尚未攻克的癌癥之一，吉西他濱雖作為一線(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)藥物應(yīng)用于胰腺癌的化學(xué)治療中，但是由于原發(fā)和獲得性耐藥性的存在，只有一部分胰腺癌病人對(duì)吉西他濱敏感；因此胰腺癌的化學(xué)治療效果欠佳，從預(yù)防、診斷、治療到預(yù)后效果都不理想。隨著我國(guó)生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年來(lái)胰腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)并且有年輕化傾向；美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)2015年統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，胰腺癌在所有癌癥中的發(fā)病率在女性中占到了第8位，然而男女致死率均上升到了第四位，五年生存率只有7%。因此尋找新的安全而有效的胰腺癌治療藥物已經(jīng)成為腫瘤治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，尤其是關(guān)于特異性靶向胰腺癌細(xì)胞生存相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑藥物的研究，已成為目前胰腺癌研究的熱點(diǎn)。
[0003]白藜蘆醇(Resveratrol, RSV)是一種廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等多種植物中的多酚化合物，是一種天然的植物抗毒素，是防治腫瘤的綠色抗癌藥物。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，白藜蘆醇對(duì)大多數(shù)腫瘤的起始、增殖、發(fā)展這三個(gè)主要階段均有抑制乃至逆轉(zhuǎn)作用。其抗腫瘤機(jī)制可以通過(guò)抗氧化、阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抑制環(huán)氧化物酶和細(xì)胞色素酶P450的活性、干擾相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、抑制腫瘤血管生成等發(fā)揮作用。但與臨床一線(xiàn)抗腫瘤藥物相比，活性相對(duì)較低，其機(jī)制可能與可上調(diào)促癌基因VEGF-B的表達(dá)相關(guān)。
[0004]二甲雙胍(Metformin，MET)是目前臨床上治療2型糖尿病的一線(xiàn)口服降糖藥。近年來(lái)多項(xiàng)體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)多種腫瘤具有一定程度的抑制作用，并可顯著增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤作用。而相關(guān)的臨床研究同樣表明，服用二甲雙胍的糖尿病患者罹患惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)以及腫瘤相關(guān)死亡率明顯小于采用其他降糖藥物或胰島素治療的糖尿病患者，從而顯示其抗癌效果與降血糖效果無(wú)關(guān)。在患有糖尿病的乳腺癌或肺癌或胰腺癌患者中，接受化療的同時(shí)服用二甲雙胍可能與更好的預(yù)后密切相關(guān)，提示二甲雙胍可能具有增強(qiáng)化療方案臨床療效的作用。盡管已有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床證據(jù)的支持，二甲雙胍抑制腫瘤的作用機(jī)制至今仍不清楚。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，二甲雙胍可下調(diào)胰腺癌細(xì)胞中促癌基因VEGF-B的表達(dá)，同時(shí)結(jié)合二甲雙胍可增強(qiáng)化療藥物臨床療效的實(shí)驗(yàn)及臨床證據(jù)，我們認(rèn)為二甲雙胍能夠增強(qiáng)白藜蘆醇對(duì)胰腺癌的抗癌作用，而二甲雙胍聯(lián)合白藜蘆醇極有可能成為胰腺腫瘤的有效治療方案，這同樣需要體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。我們分別在體外細(xì)胞模型和裸鼠皮下移植瘤模型中，對(duì)二甲雙胍聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)胰腺癌細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行了驗(yàn)證；并且我們通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)二甲雙胍聯(lián)合白藜蘆醇用以治療胰腺癌的可能性及其作用機(jī)制進(jìn)行了一定的探討研究。
[0005]目前，將天然產(chǎn)物白藜蘆醇與二甲雙胍組合用于治療腫瘤，還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道；并且白藜蘆醇與二甲雙胍的單藥使用的臨床副作用要遠(yuǎn)小于臨床一線(xiàn)的抗腫瘤藥物，具有深遠(yuǎn)的臨床應(yīng)用價(jià)值及意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述技術(shù)分析和存在問(wèn)題，提供一種將白藜蘆醇和二甲雙胍組合用于抗腫瘤藥物，該組合藥物在應(yīng)用于抗腫瘤治療中活性更高、更有效。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0008]—種將白藜蘆醇和二甲雙胍組合用于抗腫瘤藥物，所述白藜蘆醇為白藜蘆醇及白藜蘆醇類(lèi)衍生物，二甲雙胍為各種形式的二甲雙胍或其藥學(xué)上可接受的鹽；細(xì)胞用藥的白藜蘆醇與二甲雙胍的摩爾比為1:10-200 ;動(dòng)物用藥的白藜蘆醇與二甲雙胍的重量比為1:4.2;藥物組合應(yīng)用中的白藜蘆醇和二甲雙胍同時(shí)使用或以任何先后的順序使用；所述抗腫瘤藥物用于治療腫瘤包括但不限于結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、腎癌、胃癌、腦瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或前列腺癌。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0010]I)白藜蘆醇與二甲雙胍都是常見(jiàn)藥物、易于制備且安全性高；
[0011]2)白藜蘆醇與二甲雙胍同時(shí)給藥對(duì)胰腺癌及腫瘤均有協(xié)同的抑制作用，通過(guò)白藜蘆醇和二甲雙胍組合殺死人胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞試驗(yàn)、裸鼠皮下移植瘤的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明:該白藜蘆醇和二甲雙胍組合藥物治療胰腺癌具有顯著的協(xié)同效應(yīng)，提高了藥物療效并減少了副作用，效果顯著，具有醫(yī)學(xué)上的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1 (A)為二甲雙胍和白藜蘆醇作用于胰腺癌癌細(xì)胞給藥方式模式圖。
[0013]圖2(B1、B2、B3)為白藜蘆醇和二甲雙胍單獨(dú)或聯(lián)合治療分別對(duì)三種胰腺癌細(xì)胞增殖活性的抑制效果(*P〈0.05VS CON, #P<0.05VS RSV)。
[0014]圖3為二甲雙胍和白藜蘆醇對(duì)3種胰腺癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，其中:A為白藜蘆醇和二甲雙胍單獨(dú)或聯(lián)合治療3種胰腺癌細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果，B1、B2、B3為白藜蘆醇和二甲雙胍單獨(dú)或聯(lián)合治療3種胰腺癌細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(*P〈0.05VS CON，#Ρ<0.05VS MET，$P<0.05VS RSV)。
[0015]圖4A、B為二甲雙胍和白藜蘆醇聯(lián)合使用對(duì)3種胰腺癌細(xì)胞系的VEGF-B、Bax,Cleaved-caspase3、p-GSK3 β /GSK3 β蛋白表達(dá)的影響，即白藜蘆醇和二甲雙胍單獨(dú)治療或聯(lián)合治療前后，3種胰腺癌細(xì)胞系中VEGF-B，p-GSK3 β，GSK3 β，Cleaved_caspase3，Bax蛋白的表達(dá)情況及定量分析(*P〈0.05VS CON, #Ρ<0.05VS RSV，$P<0.05VS MET)。
[0016]圖5為白藜蘆醇和二甲雙胍單獨(dú)治療或聯(lián)合治療對(duì)胰腺癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用其中:A為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模式圖；B為各實(shí)驗(yàn)組裸小鼠胰腺癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)曲線(xiàn)；C為各實(shí)驗(yàn)組最后胰腺癌皮下移植瘤體積的對(duì)比分析；D為各實(shí)驗(yàn)組最后胰腺癌皮下移植瘤重量的對(duì)比分析；E為各實(shí)驗(yàn)組裸小鼠攜帶皮下移植瘤的體重分析(*P〈0.05VS CON,#Ρ<0.05VS RSV，$P<0.05VS MET)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1:
[0018]白藜蘆醇與二甲雙胍聯(lián)合應(yīng)用對(duì)3種胰腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖的抑制作用
[0019]1.所用材料:
[0020]三種人胰腺癌細(xì)胞系為Miapaca-2、PANC-U Capan-2 ;白藜蘆醇為購(gòu)買(mǎi)于Sigma，無(wú)菌二甲基亞砜配制lOOmmol/1母液，分裝，_20°C保存，稀釋使用；二甲雙胍為購(gòu)買(mǎi)于Sigma,無(wú)菌PBS水溶解，分裝，4°C保存，稀釋使用；配制含10% FBS、I % PS的DMEM和1640培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)，CCK8細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)。
[0021]2.應(yīng)用方法:
[0022]I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5X104個(gè)/mL的濃度接種于在96孔板(100 μ L/孔)；
[0023]2)貼壁培養(yǎng)24h后，棄掉培養(yǎng)基，向培養(yǎng)板加入不同濃度(lmM、5mM、10mM、20mM)的二甲雙胍和白藜蘆醇藥物及組合藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時(shí)；
[0024]3)棄去舊的培養(yǎng)液，向每孔加入含有10% CCK8溶液的培養(yǎng)基10uL ；
[0025]4)將培養(yǎng)板放在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時(shí)；
[0026]5)用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度；
[0027]6)細(xì)胞增殖活力計(jì)算:
[0028]細(xì)胞活力*(%) = [A(加藥)_A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]X100
[0029]A (加藥):具有細(xì)胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的吸光度；
[0030]A (空白):具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度；
[0031]A(O加藥):具有細(xì)胞、CCK8溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度。
[0032]3.檢測(cè)結(jié)果
[0033]采用CCK8法檢測(cè)不同細(xì)胞系和不同藥物處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)情況，從圖1(A)、圖2 (B1、B2、B3)結(jié)果顯示可以看出使用不同濃度二甲雙胍(lmM，5mM，1mM，2OmM)處理Miapaca-2細(xì)胞48h后，各組細(xì)胞存活率為97% ,91% ,88%，80%，與對(duì)照組100%相比，二甲雙胍(lmM，5mM，1mM)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，二甲雙胍20mM有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0.038);當(dāng)不同濃度的二甲雙胍與白藜蘆醇(10uM)聯(lián)合使用后，各組細(xì)胞存活率為78%，71%，61%，37%，與二甲雙胍單獨(dú)用藥各組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并且與白藜蘆醇單獨(dú)用藥組的72%相比，20mM 二甲雙胍與白藜蘆醇聯(lián)合組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.001) O
[0034]同樣方法處理PANC-1細(xì)胞48h后，二甲雙胍單用各組細(xì)胞存活率為90 %，93 %，82%，54%，與對(duì)照組比較，20mM 二甲雙胍處理后，有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0.001) ; 二甲雙胍與白藜蘆醇(10uM)聯(lián)合使用，各組細(xì)胞存活率為67%，62%，56%，34%，與二甲雙胍(5mM，10mM)單獨(dú)用藥各組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與單用白藜蘆醇71 %比較，20mM二甲雙胍與白藜蘆醇聯(lián)合處理，具有顯著差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)。處理Capan-2細(xì)胞48h后，二甲雙胍單用各組細(xì)胞存活率為85 %，81 %，78 %，63 %，與對(duì)照組比較，均有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)，當(dāng)二甲雙胍與白藜蘆醇(10uM)聯(lián)合使用，各組細(xì)胞存活率為81%，67%，65%，46%，與二甲雙胍(5mM，10mM，20mM)單獨(dú)用藥各組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與單用白藜蘆醇84%比較，二甲雙胍(5mM，10mM，20mM)與白藜蘆醇聯(lián)合處理均有顯著差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.001)。綜合不同濃度的二甲雙胍單獨(dú)處理及與白藜蘆醇聯(lián)合處理后，