酶（ALT)和 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST)活性水平來評價藥效，然后將有效單體進行劑量配伍并據(jù)上述 指標篩選最佳配比方案。
[0033] 1.建立脂肪變性細胞模型
[0034] WImM游離脂肪酸（FFA)，包含不同比例油酸和棟桐酸，刺激化pG2和L02細胞 2地，油紅染色倒置光學顯微鏡觀察細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，細胞上清ALT活性在脂肪酸誘導 化pG2和L02細胞24h后較對照顯著上調(diào)，表明成功構(gòu)建單純脂肪變性模型和伴有細胞調(diào)亡 的脂肪變性模型。
[0035]2.單一組分處理細胞
[0036] 分別用各單一組分的高中低劑量處理FFA(2:1)誘導脂肪變性的化pG2及L02細 胞2地，應(yīng)用油紅0染色觀察各組分在各劑量對細胞脂肪變性的影響。結(jié)果顯示，模型組細 胞腫脹，并有大量脂滴積聚，原人參二醇、丹參酬IIA、大黃素高中劑量干預(yù)組細胞內(nèi)脂滴明 顯減少，其余干預(yù)組細胞內(nèi)脂滴也有輕度減少，圖中標記I為原人參二醇，II為丹參酬IIA， III為大黃素。
[0037] 用尼羅紅染色后微孔板檢測巧光強度顯示，原人參二醇、丹參酬IIA、大黃素高中 劑量可下調(diào)巧光強度值（P<〇. 05)其它組有下調(diào)趨勢，與油紅染色觀察結(jié)果一致。
[0038] 3.應(yīng)用權(quán)重配方法獲得6組配比方案、篩選最佳配伍
[0039] 取有效單體原人參二醇、丹參酬IIA、大黃素進行劑量配伍，獲得6組配伍藥物（如 表1所示）。
[0040] 表1.復方制劑中組分單體濃度配伍（umol/L)
[0041]
[0042]
[0043] 直接用6個配伍組A-F原劑量處理脂肪變性細胞，部分組細胞死亡數(shù)多，表明有細 胞毒性，因此W配伍后稀釋10倍劑量進行試驗干預(yù)脂肪變性的化PG2及L02細胞研究藥 效。
[0044] 油紅染色顯示模型組細胞脂肪大量積聚，各組藥物均不同程度地減輕脂滴含量 (圖1、圖2)。細胞甘油S脂（triglyceride,TG)檢測顯示配伍C、F組在化pG2細胞有顯 著降低TG作用，在L02細胞中除C、F外還有A組發(fā)揮顯著作用，F(xiàn)組藥效最顯著。各組總 膽固醇（total化olesterol，TC)含量無顯著改變（圖3)。
[0045]連施例2 (闡冰.最值藥物成分配比方案的藥效柄，制)
[0046] 選取降脂和降轉(zhuǎn)氨酶最有效的藥物及配伍F，對脂肪變性的化pG2細胞干預(yù)，進行 進一步藥效機制的初步探討，主要包括氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝相關(guān)信號分子。
[0047] 1.氧化應(yīng)激相關(guān)機制
[004引首先檢測藥物對細胞中氧自由基含量的影響。利用巧光探針DCFH-DA進行細胞 內(nèi)活性氧（R0巧檢測，對照細胞無明顯綠色巧光，模型組細胞內(nèi)有較強綠色巧光，說明用 Immol/L油酸和棟桐酸建立的脂肪變性肝細胞存在氧化應(yīng)激反應(yīng)，藥物F可明顯減輕R0S含 量（圖4)。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醒（malondialdehyde，MDA)及可造成R0S增加的氧化應(yīng)激 關(guān)鍵分子細胞色素P450亞型沈1 (巧toe虹omeP450沈1，CYP沈1)在模型組上調(diào)，藥物F的 干預(yù)使其含量顯著下降（圖5)。
[0049] 2.甘油S脂代謝相關(guān)機制
[0050] 由于藥物對細胞內(nèi)TG有較顯著調(diào)節(jié)作用，因此檢測TG合成相關(guān)分子。AMPK的 活化可抑制脂肪合成酶乙酷CoA簇化酶（AcetylCoAcarboxylase,ACC)和脂肪酸合成酶 (fattyacidsynthetase,FA巧表達和活化，因此對運幾個指標進行檢測。Westernblot 表明模型組AMPK活化水平下調(diào)，而ACC的活化及FAS表達水平顯著增高，藥物F對此均有 所改善（圖6)。
[0051]連施例3 (最值成分配比藥物在小鼠體內(nèi)試驗藥效)
[0052]SPF級雄性巧7BL/6小鼠，約20g，隨機分為對照組（C)、模型組（M)、F高劑量（HF)、 F中劑量（MF)、F低劑量（L巧和黃連素組度BR)。除對照給予正常飼料外，其余予60%高脂 飼料。造模3周后，各干預(yù)組予W相應(yīng)藥物灌胃4周。其中H高中低組分別給予藥物F52、 26、13mg/kg/day，BBR組給予黃連素lOOmg/kg/day。藥物干預(yù)4周后空腹化，稱體重，摘眼 球取血并分離血清凍存待測，頸椎脫白處死，取肝組織稱重，肝組織凍存于-80°C冰箱備用， 或置于包埋盒于10%甲醒固定。檢測血清及肝臟各指標。
[0053] 1.藥物對肝重、體重的影響
[0054] 圖7顯示，予高脂飼料各組小鼠體重均較正常組有增高，各藥物干預(yù)組對此無明 顯改變。各組間肝重變化不明顯。
[00巧]2.藥物對血脂和血糖的影響
[0056] 圖8示第7周模型組血清TC、皿心(3、LDkc及血清空腹血糖（FBG)均顯著高于正 常對照，F(xiàn)各劑量組對血脂和血糖均有一定下調(diào)作用，其中HF對TC、皿L-C干預(yù)顯著，其余 為下調(diào)趨勢，H各劑量及BBR均可顯著下調(diào)LDL-C含量，對血糖干預(yù)不顯著。
[0057] 3.藥物對血清轉(zhuǎn)氨酶的影響
[0058] 模型組血清ALT、AST升高顯著，各藥物組較M有改善趨勢，其中HF明顯下調(diào)AST, 見圖9。
[0059] 4.肝臟組織病理變化
[0060] 肝組織石蠟切片肥染色（圖10)觀察，模型組W小葉中央靜脈區(qū)周圍彌漫性肝細 胞脂肪變性，無明顯炎性細胞浸潤；各藥物干預(yù)組脂質(zhì)積聚均有改善，HF最優(yōu)。
[0061] 5.藥物對肝脂含量的影響
[0062] 圖11表明，模型組肝臟TG含量較正常飲食鼠升高明顯，HF及黃連素組顯著下調(diào) 其含量，WHF效果最優(yōu)，歷、化有下調(diào)肝脂的趨勢。
[006引結(jié)論
[0064] 綜上所述，本發(fā)明中藥有效成分復方制劑可有效降低肝細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚，另外篩 選出最佳降脂配伍F組，可改善非酒精性脂肪肝模型小鼠肝脂積聚、下調(diào)血脂及減輕肝損 傷。進一步機制研究掲示配伍F的改善細胞脂肪變性的藥效機理包括對氧化應(yīng)激和AMPK 相關(guān)脂肪合成信號通路的調(diào)節(jié)。
【主權(quán)項】
1. 一種治療非酒精性脂肪性肝病的中藥有效成分復方制劑，其特征在于，由三種中藥 有效成分原人參二醇、丹參酮IIA和大黃素組成，原人參二醇、丹參酮IIA和大黃素的摩爾 比為（10 ~100): (10 ~100): (1 ~10)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療非酒精性脂肪性肝病的中藥有效成分復方制劑，其特征 在于，原人參二醇、丹參酮IIA和大黃素的摩爾比為10:10:1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的治療非酒精性脂肪性肝病的中藥有效成分復方制劑，其 特征在于，所述復方制劑為片劑、顆粒劑、膠囊或口服液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療非酒精性脂肪性肝病的中藥有效成分復方制劑，其特征 在于，非酒精性脂肪性肝病為肝臟脂肪積聚及肝損傷。5. 權(quán)利要求1或2所述的中藥有效成分復方制劑在制備治療非酒精性脂肪性肝病的藥 物中的用途。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，非酒精性脂肪性肝病為肝臟脂肪積聚及 肝損傷。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治療非酒精性脂肪性肝病的中藥有效成分復方制劑，其特征在于，由三種中藥有效成分原人參二醇、丹參酮IIA和大黃素組成，原人參二醇、丹參酮IIA和大黃素的摩爾比為(10～100):(10～100):(1～10)。本發(fā)明中藥有效成分復方制劑，可按照常規(guī)方法制備成臨床常用制劑，包括片劑、顆粒劑、膠囊或口服液。本發(fā)明中藥有效成分復方制劑經(jīng)應(yīng)用權(quán)重配方法設(shè)計按照各藥物不同劑量比例配伍，并通過干預(yù)脂肪酸誘導的肝細胞脂肪變性效應(yīng)篩選得出，可顯著改善肝細胞脂肪變性，降低非酒精性脂肪肝小鼠血脂水平及減輕肝臟脂肪積聚和肝細胞損傷。
【IPC分類】A61P1/16, A61K31/58, A61K31/575, A61K31/122
【公開號】CN105147701
【申請?zhí)枴緾N201510311853
【發(fā)明人】宋海燕, 季光, 劉洋, 王立娟, 張莉, 徐漢辰
【申請人】上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年6月9日