，分離膠： 140￥)，然后轉(zhuǎn)印于？￥0。膜，并用5%脫脂牛奶（溶解于1851'(含0.1%1^6611-20的185緩 沖液）中）封閉非特異性結(jié)合位點，室溫比。然后進(jìn)行一抗解育（anti-AGEs，1:3000;ant 1-66口0，1:1000，曰11^-1'1(，1:1000)，4°(：過夜。用1851'洗口￥0尸膜，10111111/次，3次，加入辣根 過氧化物酶（HR巧偶聯(lián)的山羊抗鼠/兔二抗（1:5000)解育，室溫比。隨后用TBST洗膜， lOmin/次，3次，用E化超敏發(fā)光液淋洗PVDF膜，并對X-光片進(jìn)行曝、顯影、定影，顯示目的 蛋白條帶。用如antity化e4. 6. 2度ioRad)進(jìn)行灰度掃描，統(tǒng)計結(jié)果。
[0030] 5.總RNA提取使用德國Qiagen公司的RNeasyMicroKit,具體方法參見說明書。 cDNA第一條鏈合成使用Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。不同基因使用的引物如下表：
[0031]
[0032]PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)根據(jù)每個基因的自身特征從24個循環(huán)到30個循環(huán)不等。TK的退 火溫度為52度，其余為56度D對于實時定量（realtimequantitative)PCR，cDNA模板稀 釋10倍后使用，采用全式金公司的TransStartGreenqPCRSuperMixUDGkit,相對表達(dá) 水平的比較采用2-AAct法，具體方法參見說明書，每個實驗重復(fù)蘭次。
[003引結(jié)果分析
[0034] 給實驗動物灌胃苯麟硫胺四個月，2型糖尿病組、灌胃組與恢復(fù)組大贏的體重、血 糖水平、膜島素、膜島素C版、膜島素抗體與膜高血糖素都顯著高于（p<0. 001)瘦型對照組 (圖1)，說明灌胃苯麟硫胺無法改善體內(nèi)血糖與膜島素水平。灌胃苯麟硫胺組與2型糖尿 病組相比，尿核糖隨時間變化（圖2) 及血清中核糖濃度（圖3A)說明苯麟硫胺可降化 體內(nèi)核糖濃度。同時，可顯著降化（P<〇.001)血清中糖化血紅蛋白的含量（圖3B)。通 過westernblotting分析，灌胃苯麟硫胺可顯著降化（p<0. 001)肝臟、腎臟、血清中AGES 的量（圖4)。同時，real-timePCR與westernblotting技術(shù)分析表明，灌胃苯麟硫胺后 肝臟中轉(zhuǎn)酬醇酶的mRNA水平與蛋白表達(dá)水平都顯著高于（p<0. 001)2型糖尿病組與恢復(fù)組 (圖5)。提示麟酸戊糖途徑中轉(zhuǎn)酬醇酶是體內(nèi)核糖代謝關(guān)鍵酶。
[0035] 參考文獻(xiàn)：
[0036] [IjKumar, Vinay, Fausto, et al.民obbins and Cotran Pathologic Basis of Disease. 7化.Philadelphia, Pa:Saunders, 2005:1194-1195
[0037] [2]Vlassara比Advanced glycation in health and disease:role of the modern environment. AnnN YAcad Sci,2005, 1043(1):452-460
[0038] [3]Melpomeni P, Jaime U, Helen V，et al. Glucose, advanced glycation end products,and diabetes comp1ications:what is new and what works. Clinical Diabetes, 2003, 21 (4) : 186
[0039] [4]Weast, Robert C. CRC Handbook of ChemistiT and Physics. 62nd. Boca Raton, FLiCRC Press, 1981, p. C-506
[0040] 巧]WeiY,QienLQienJ,etal.RapidglycationwithD-Riboseinduces globularamyloid-likeaggregationsofBSAwithhighcytotoxicitytoSY5Ycells. BMCCellBiology, 2009:10:10
[0041] [6]Chen L, Wei Y, Wang X Q, et al.民ibosylation rapidly induces a -synuclein protein into advanced glycation end products in molten globules with high cytotoxicity. PLoS ONE, 2010,5 (2):e9052
[0042] [7]Chen L,Wei Y,Wang X Q, et al.D-Ribosylated Tau forms globular aggregates with hi組cytotoxicity.Cell Mol Life Sci,2009,66 (15):2559-2571
[0043] [8]AgnewWF.Christiancronepermeabilityofbraincapillaries tohexosesandpentosesintherabbit.ActaPhysiologicaScandinavi ca，1967, 70 (20): 168-175
[0044] [9]Wei Y, Han C H, Zhou J, et al. D-Ribose in glycation and protein aggregation. Biochim Biophys Acta,General Subjects, 2012, 1820(4):488-494 [10] Han C, Lu Y,Wei Y, et al.D-ribose induces cellular protein glycation and impairs mouse spatial cognition?化oS One, 2011.6巧）：e24623.
【主權(quán)項】
1. 苯磷硫胺用于制備降低體內(nèi)核糖水平的藥物的用途。2. 苯磷硫胺用于制備減少內(nèi)源核糖蓄積后毒性的藥物的用途。3. 苯磷硫胺用于制備降低體內(nèi)糖化血紅蛋白水平的藥物的用途。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的用途，所述降低體內(nèi)核糖水平、減少內(nèi)源核糖蓄積 后毒性，以及低體內(nèi)糖化血紅蛋白水平，通過促進(jìn)磷酸戊糖途徑中的轉(zhuǎn)酮醇酶活性來實現(xiàn)。5. 苯磷硫胺用于制備通過促進(jìn)參與磷酸戊糖途徑中的轉(zhuǎn)酮醇酶活性，治療核糖代謝失 調(diào)引起的相關(guān)疾病的藥物的用途。6. 苯磷硫胺用于制備通過降低體內(nèi)核糖水平，治療核糖代謝失調(diào)引起的相關(guān)疾病的藥 物的用途。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的用途，所述核糖代謝失調(diào)引起的相關(guān)疾病包括糖尿病、老 年癡呆、動脈粥樣硬化。
【專利摘要】本發(fā)明涉及苯磷硫胺用于治療核糖代謝相關(guān)疾病的用途，具體是采用苯磷硫胺降低體內(nèi)核糖水平，同時減少內(nèi)源核糖蓄積后的毒性。研究表明內(nèi)源核糖蓄積后，會導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物的增加，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致機(jī)體功能損傷，如參與糖尿病、老年癡呆等核糖相關(guān)疾病。本發(fā)明中苯磷硫胺的使用能夠有效降低體內(nèi)核糖水平，改善疾病。
【IPC分類】A61P3/10, A61K31/675, A61P25/28, A61P3/00, A61P9/10
【公開號】CN105147708
【申請?zhí)枴緾N201510413063
【發(fā)明人】赫榮喬, 蘇濤, 陳茜茜, 魏艷
【申請人】中國科學(xué)院生物物理研究所
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年7月14日