一種中大型植物外植體的滅菌方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種中大型植物外植體的滅菌方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 外植體的有效滅菌是所有植物組織培養(yǎng)的重要一步。植物組織培養(yǎng)是指從植物體 上截取需要的細(xì)胞、組織或器官，通過無菌操作，在人為調(diào)控下進(jìn)行培養(yǎng)，廣泛應(yīng)用于溯危、 稀有植物的長期保存、經(jīng)濟植物的快速繁殖、遠(yuǎn)源雜交崎形胚或未成熟胚胎的挽救、培養(yǎng)， 新型種質(zhì)資源的創(chuàng)造值H、基因工程、細(xì)胞融合）、脫毒復(fù)壯等領(lǐng)域。
[0003] 與醫(yī)療器械、食品加工等行業(yè)的消毒不同，保持外植體在消毒后依然具有較高的 生命力是植物組織培養(yǎng)必須要堅守的原則。物理消毒法，如福射消毒、高溫、高壓、蒸汽滅菌 等都會導(dǎo)致外植體死亡。因此組織培養(yǎng)領(lǐng)域?qū)ν庵搀w的消毒方法均是采用化學(xué)法。從植物 組織培養(yǎng)消毒技術(shù)誕生至今，相關(guān)的科研人員都在探索使用何種化學(xué)試劑才能到達(dá)有效滅 菌的目的。
[0004] 常用的化學(xué)試劑有乙醇、次氯酸鋼、氯化隸（升隸）、過氧化氨、次氯酸巧和硝酸 銀。氯化隸較難在隨后的洗涂過程中去除，且對外植體有毒副作用。過氧化氨是強氧化劑， 滴落到皮膚后會有灼傷感。氯化隸和過氧化氨作用較強，如果濃度稍大或時間略長，外植體 很容易死亡。次氯酸巧容易吸收空氣中的水分，影響滅菌效果。硝酸銀也是強氧化劑，但 滅菌能力不如氯化隸和過氧化氨，價格又比乙醇和次氯酸鋼貴，所W較少采用。綜合滅菌效 果、安全系數(shù)和價格因素，乙醇和次氯酸鋼是目前最為廣泛使用的化學(xué)試劑。 陽〇化]乙醇和次氯酸鋼組合使用可W滿足一般常見外植體的消毒要求。目前植物外植體 的通用消毒方法是：體積百分比濃度為75%的乙醇表面處理20秒-90秒后，再用體積百分 比濃度為2-15%次氯酸鋼水溶液消毒8-20分鐘，再用無菌蒸饋水漂洗2-4次，每次1-2分 鐘。采用該消毒方法，需要對大量蒸饋水進(jìn)行高壓滅菌W制備得到無菌蒸饋水。如果不能 達(dá)到滅菌效果，再使用其它的化學(xué)試劑。
[0006] 有些中大型外植體，如百合果實、茄果類幼果、葫蘆科幼果、馨葫科塊莖等等體積 較大，一般長度或者長徑超過4cm，采用目前業(yè)界通用的消毒技術(shù)，有W下幾個缺點：1、受 滅菌器材的限制，每次只能對幾個外植體進(jìn)行消毒，滅菌效率低下；2、內(nèi)部具較大空腔的 外植體，如百合果實，內(nèi)部空腔體積大，比重輕，密度小，在整個消毒過程中均漂浮在液體表 面，容易導(dǎo)致表面消毒不完全，從而造成污染；3、馨葫科塊莖在±中生長，攜帶多種、大量菌 類，不易徹底消毒，采用傳統(tǒng)滅菌方法的滅菌效率低下。
[0007] 因此，植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域需要研發(fā)出一種針對于中大型植物外植體的、快速高效 的、成本低廉的、操作簡單的滅菌方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供一種中大型植物外植體的滅菌方法，該方法將外植體先用乙醇溶液浸 泡，再在火焰中灼燒并冷卻。
[0009] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0010] 一種中大型植物外植體的滅菌方法，包括W下步驟：
[0011] 浸泡步驟：將外植體在乙醇溶液中進(jìn)行浸泡處理，得到浸泡后的外植體；
[0012] 灼燒步驟：將所述浸泡后的外植體進(jìn)行灼燒處理，得到滅菌后的外植體。
[0013] 上述滅菌方法的優(yōu)選的實施方式中，所述外植體的長度或長徑大于等于4cm，小于 等于15cm。
[0014] 上述滅菌方法的優(yōu)選的實施方式中，所述外植體為百合果實、番茄幼果、茄子幼 果、西瓜幼果、馨葫塊莖。
[0015] 上述滅菌方法的優(yōu)選的實施方式中，所述浸泡步驟中，所述浸泡處理的時間為1-5 秒，優(yōu)選為1-3秒。
[0016] 上述滅菌方法的優(yōu)選的實施方式中，所述浸泡步驟中，所述乙醇溶液的體積百分 濃度為90 % -99 %，優(yōu)選為95 % -99 %。
[0017] 上述滅菌方法的優(yōu)選的實施方式中，所述灼燒步驟中，所述灼燒處理的時間為 1-30秒，優(yōu)選為2-20秒。
[0018] 上述滅菌方法的優(yōu)選的實施方式中，所述浸泡步驟和灼燒步驟均在超凈工作臺中 進(jìn)行。
[0019] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0020] 1、本發(fā)明無需采用次氯酸鋼溶液、升隸溶液等對外植體進(jìn)行消毒，也無需對大量 蒸饋水進(jìn)行高壓滅菌，所W操作簡單、節(jié)省試劑、對環(huán)境友好。
[0021] 2、本發(fā)明采用的灼燒處理屬于物理消毒法，是現(xiàn)有技術(shù)中被認(rèn)為的完全不可能應(yīng) 用于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域的消毒方法，所W本發(fā)明的滅菌方法打破了上述技術(shù)偏見，是對植 物組織培養(yǎng)領(lǐng)域傳統(tǒng)消毒觀念的徹底轉(zhuǎn)變。
[0022] 3、本發(fā)明適用于用傳統(tǒng)的滅菌方法效果不佳的中大型外植體，包括：百合果實、茄 果類幼果、葫蘆科幼果、馨葫科塊莖等，使用范圍廣泛。
[0023] 4、本發(fā)明操作簡便，成本低廉，快速高效，容易推廣，應(yīng)用價值高。
【具體實施方式】
[0024] 一種中大型植物外植體的滅菌方法，包括W下步驟：
[00巧]步驟一、浸泡：在超凈工作臺內(nèi)，將清洗去除表面浮塵的外植體在體積百分濃度為 90 % -99 %，優(yōu)選為95 % -99 %乙醇溶液中進(jìn)行浸泡處理1-5秒，優(yōu)選為1-3秒，得到浸泡后 的外植體。
[0026] 示例性地，上述乙醇溶液的濃度可W為90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96 %、 97%、98%、99%中的任意值或任意兩者之間的范圍；上述浸泡的時間可W為1秒、2秒、3 秒、4秒、5秒中的任意值或任意兩者之間的范圍。
[0027] 上述中大型外植體，包括：百合果實、茄果類幼果、葫蘆科幼果、馨葫科塊莖等等， 體積較大，一般長度或者長徑超過4cm，采用目前業(yè)界通用的化學(xué)滅菌方法對運些外植體滅 菌，耗時長、效率低，很難令人滿意。
[0028] 步驟二、灼燒：在超凈工作臺內(nèi)，將浸泡后的外植體過火進(jìn)行灼燒處理累計為 1-30秒，優(yōu)選為2-20秒，待火焰徹底焰滅，外植體冷卻后，得到滅菌后的外植體；再對該滅 菌后的外植體進(jìn)行后續(xù)的操作。
[0029] 示例性地，上述灼燒累計的時間可W為1秒、2秒、5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、 30秒中的任意值或任意兩者之間的范圍。
[0030] 該滅菌方法的操作中無需采用次氯酸鋼溶液、升隸溶液等對外植體進(jìn)行消毒，也 無需對大量蒸饋水進(jìn)行高壓滅菌，所W操作簡單、節(jié)省試劑、對環(huán)境友好；該滅菌方法采用 的灼燒處理屬于物理消毒法，在現(xiàn)有技術(shù)中被認(rèn)為是一種完全不可能應(yīng)用于植物組織培養(yǎng) 領(lǐng)域的消毒方法，該滅菌方法打破了上述技術(shù)偏見，是對植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域傳統(tǒng)消毒觀念 的徹底轉(zhuǎn)變，徹底突破了之前植物組織消毒技術(shù)理論和經(jīng)驗的束縛；該滅菌方法的操作適 用于用傳統(tǒng)的滅菌方法效果不佳W及效率低下的中大型外植體，包括：百合果實、茄果類幼 果、葫蘆科幼果、馨葫科塊莖等，使用范圍廣泛；該滅菌方法的操作簡便，成本低廉，快速高 效，容易推廣，應(yīng)用價值高。
[0031] W下通過具體的實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但運些例舉性實施方式并非旨在 對本發(fā)明的實際保護范圍構(gòu)成任何形式的任何限定。 陽0巧 實施例1
[0033] 本實施例的外植體為授粉后45-60天的百合果實，長徑為6-9厘米；其內(nèi)部具有較 大空腔，比重輕，密度小，如采用傳統(tǒng)的滅菌方法進(jìn)行滅菌，則在整個消毒過程中均漂浮在 液體表面，容易導(dǎo)致表面消毒不完全，從而造成污染。
[0034] 本實施例的滅菌方法包括W下步驟：
[0035] (1)清洗：摘取授粉后45-60天的百合果實，用清水洗去其表面浮塵，吸水紙吸凈 水份。
[0036] (2)浸泡：在無菌操作臺內(nèi)，用綴子夾住果實在體積百分濃度為95%的乙醇溶液 (可多次重復(fù)使用）中來回測動=五下，約1-3秒，得到浸泡后的果實。
[0037] (3)灼燒和冷卻：將浸泡后的果實過火灼燒2-3秒；再將其放入無菌蒸饋水中滅 火、冷卻，得到滅菌后的果實。
[0038] (4)再將果實在無菌吸水紙上來回滾動2、3下即可進(jìn)行隨后的植物組織培養(yǎng)等操 作。
[0039] 傳統(tǒng)化學(xué)滅菌方法與本實施例的滅菌方法效果的比較：
[0040] (1)對照組：采用化學(xué)滅菌法，具體步驟為：先將清洗后的外植體于體積百分濃度 為75%乙醇溶液中浸泡振蕩30-50秒，再于體積百分濃度為2. 5%的次氯酸鋼溶液中浸泡 振蕩14-15分鐘，再用無菌蒸饋水清洗3-4次，每次1-2分鐘，再于無菌吸水紙上吸干外植 體表面的水分。
[0041] 實驗組：采用本實施例的滅菌方法。
[0042] W上兩組中，每組實驗均做3次，每次10個外植體，消毒一周、二周、四周后分別統(tǒng) 計外植體的滅菌效果和生長狀況。
[0043] (2)采用對照組的化學(xué)滅菌法存在W下缺陷：果實上部大約4-6平方厘米的區(qū)域 漂浮在次氯酸鋼溶液上方，在大約15分鐘的時間里，需要人工不停地翻滾果實，保證果實 表面全部得到消毒。另外，由于果實的長徑較長，通常400ml燒杯一次最多處理2-4個果實， 即平均25分鐘只能消毒3個果實。而采用實驗組的方法，1分鐘就可W消毒2個果實。滅 菌效率提高了大約17倍，運是該方法的優(yōu)點。用該方法消毒，四周后無菌率保持100%，且 內(nèi)部種子依然具有萌發(fā)力；極其快速高效，不用次氯酸鋼，節(jié)省了大量試劑和時間。
[0044] 下表為W上兩組的平均試劑用量、時間的比較；可見實驗組的乙醇溶液、次氯酸鋼 溶液、無菌蒸饋水的用量均遠(yuǎn)小于對照組，實驗組的時間也遠(yuǎn)少于對照組。
[0045]
[0046] 注：1、乙醇可W反復(fù)使用；2、400ml燒杯中一次可放入2個百合果實。
[0047] 對照組和實驗組培養(yǎng)2周后統(tǒng)計幼胚萌發(fā)情況，對照組的平均幼胚萌發(fā)率為 87 %，實驗組的平均幼胚萌發(fā)率為83 %，沒有顯著差異。 引實施例2
[0049] 本實施例的外植體為授粉后15-25天的番茄幼果。按照果實大小，通常把番茄分 為小果、中果和大果=個類型。本實施例的方法在處理中果，特別是大果類型時，有突出的 優(yōu)勢。一般中果的長徑為4-6厘米，大果的長徑為5-7為厘米。
[0050] 本實施例的滅菌方法包括W下步驟：
[0051] (1)清洗：摘取授粉后15-25天的番茄幼果，用清水洗去其表面浮塵，吸水紙吸凈 水份。
[0052] (2)浸泡：在無菌操作臺內(nèi)，將幼果浸入裝有200ml的體積百分濃度為95%的乙醇 溶液（可多次重復(fù)使用）的500ml的燒杯中，翻滾1-3秒，確保幼果表面沾滿乙醇溶液，得