Dna嵌入劑的細(xì)胞遞送的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及使用DNA載體將活性劑遞送至細(xì)胞，其中活性劑嵌入至載體的DNA內(nèi)。DNA載體還可W包括使DNA載體結(jié)合至特定細(xì)胞類型的祀向劑，從而促進(jìn)嵌入的活性劑向 細(xì)胞的遞送。
[000引背景
[0003] 活性劑與DNA之間的非共價(jià)相互作用通常通過溝結(jié)合或嵌入來產(chǎn)生。具體來說， 抗癌療法的領(lǐng)域已經(jīng)產(chǎn)生了數(shù)種通過嵌入而與DNA相互作用的化療藥物，所述嵌入是設(shè)及 在DNA堿基對(duì)之間插入平面藥物分子的方法。運(yùn)導(dǎo)致DNA的螺旋形圈數(shù)和延長(zhǎng)減少。由于 良好的疏水鍵、離子鍵、氨鍵W及范德華力，嵌入的締合常數(shù)可W是IO5Mi至10 "Ml。嵌入 通常與稠環(huán)結(jié)構(gòu)相關(guān)，但非稠環(huán)系統(tǒng)也是已知的。嵌入被公認(rèn)為是成功使用運(yùn)些化合物作 為抗腫瘤劑、抗瘤劑、抗追疾劑、抗生素劑W及抗真菌劑的重要原因，因?yàn)榇蠖鄶?shù)試劑是基 因毒性的，特別當(dāng)存在堿性的、陽離子的或親電的官能團(tuán)時(shí)。
[0004]DNA樹枝狀聚合物是由相互連接的天然或合成單體寡核巧酸亞單元構(gòu)造的復(fù)雜 的、高度分支的分子。DNA樹枝狀聚合物由DNA單體構(gòu)建，每個(gè)所述DNA單體由共享位于每 個(gè)鏈的中屯、部分（又稱"腰"）的序列互補(bǔ)區(qū)的兩個(gè)DNA鏈形成，但具有四個(gè)非互補(bǔ)的單鏈 "臂"用于與其他單體的"臂"雜交。單體從單個(gè)單體開始組裝成樹枝狀聚合物，所述單個(gè)單 體通過互補(bǔ)的臂與另外的單體雜交。另外的層W類似的方式通過單體與先前的層中的單體 的臂雜交而添加。通過改變其中臂與另外的單體雜交的層的數(shù)目，產(chǎn)生不同大小和形狀的 DNA樹枝狀聚合物。為了防止DNA樹枝狀聚合物隨時(shí)間推移而分解，可W使用紫外線通過嵌 入和活化補(bǔ)骨脂素交聯(lián)劑將化學(xué)"焊點(diǎn)"添加至增長(zhǎng)的組件中。在超速離屯、之后，通常根據(jù) 樹枝狀聚合物的大小和分子量在變性薦糖梯度上對(duì)其進(jìn)行純化。
[0005]DNA樹枝狀聚合物還可W共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合各種不同類型的分子和顆粒，通常通 過連接至存在于外層上的未雜交的臂。運(yùn)些分子和顆粒可W是DNA樹枝狀聚合物上的信號(hào) 傳導(dǎo)裝置和祀向裝置，從而允許祀向DNA樹枝狀聚合物至特異性分子祀標(biāo)并且通過檢測(cè)信 號(hào)傳導(dǎo)部分檢測(cè)樹枝狀聚合物與祀標(biāo)的結(jié)合。信號(hào)產(chǎn)生部分包括大量巧光染料、半抗原、 酶和其他分子材料，W及顆粒如金納米顆粒和量子點(diǎn)。祀向裝置包括DNA、RNA和PM寡 核巧酸、抗體、抗體片段、半抗原、適體、膚W及其他祀向裝置。因?yàn)閱误w的外層含有許多未 雜交的臂，所WDNA樹枝狀聚合物構(gòu)建體在各種體外應(yīng)用中用作信號(hào)放大器，通常用于檢 測(cè)特定的核酸和蛋白質(zhì)，而且也用作電子裝置中的檢測(cè)裝置。應(yīng)用包括對(duì)于DNA和蛋白質(zhì) 微陣列、ELISA和化0SA、Luminex珠粒測(cè)定、原位雜交W及其他方面的信號(hào)放大。在調(diào)查 研究中已經(jīng)廣泛發(fā)表了標(biāo)記的和祀向的DNA樹枝狀聚合物的用途，并且運(yùn)些材料可作為由 GenisphereliX(Hatfield，PA)出售或生產(chǎn)的商業(yè)研究產(chǎn)品而獲得。
[0006] 還已經(jīng)顯示DNA樹枝狀聚合物具有作為體外和體內(nèi)應(yīng)用中的遞送裝置和轉(zhuǎn)染裝 置的潛在用途。參見例如，U.S. 2005/0089890、W02008/147526 和WO2010/017544,每個(gè)文 獻(xiàn)W引用的方式整體并入。確切來說，DNA樹枝狀聚合物與祀向裝置（例如，特異于能夠引 起細(xì)胞內(nèi)吞內(nèi)化作用事件的細(xì)胞表面特征的抗體）結(jié)合，所述祀向裝置結(jié)合祀向接受貨物 (例如，藥物）遞送的細(xì)胞上的表面特征。被動(dòng)地與祀向的DM樹枝狀聚合物締合的貨物通 過與樹枝狀聚合物的空間締合而簡(jiǎn)單地進(jìn)入細(xì)胞，但貨物也可W通過許多附接策略（包括 連接至外臂）結(jié)合樹枝狀聚合物。
[0007] 概述
[000引本發(fā)明設(shè)及一種用于使用DNA載體將活性劑遞送至細(xì)胞的改進(jìn)的方法。DNA載體 包含DNA(所述DNA的至少一部分是呈雙鏈形式）和嵌入在雙鏈DNA中的活性劑。在某些 實(shí)施方案中，DNA載體還包含結(jié)合其中待遞送活性劑的分子、細(xì)胞或組織的祀向劑。在具體 實(shí)施方案中，DNA載體是具有嵌入在樹枝狀聚合物的雙鏈部分中的活性劑的DNA樹枝狀聚 合物。當(dāng)使DNA載體結(jié)合至祀向的分子、細(xì)胞或組織時(shí)，樹枝狀聚合物通過細(xì)胞內(nèi)化至核內(nèi) 體內(nèi)，在所述核內(nèi)體中酸性抑促進(jìn)活性劑從DNA中釋放W產(chǎn)生細(xì)胞毒性或其他生物效應(yīng)。
[0009] 附圖簡(jiǎn)述
[0010] 圖IA示出用LYS0SENS0R染料標(biāo)記活細(xì)胞。圖IB示出含有內(nèi)化的樹枝狀聚合物的 細(xì)胞。圖IC是圖IA和圖IB的合并圖，其示出樹枝狀聚合物被內(nèi)化至細(xì)胞的酸性隔室內(nèi)。
[0011]圖2A-2D示出實(shí)施例2的結(jié)果：未經(jīng)處理的細(xì)胞（圖1A)，未祀向的阿霉素樹枝狀 聚合物（圖2B)、GSmAb綴合的阿霉素樹枝狀聚合物（圖2C和圖2D)。
[001引詳述
[0013] 在描述本發(fā)明的若干示例性實(shí)施方案之前，應(yīng)了解的是，本發(fā)明不限于W下描述 中所闡述的構(gòu)建步驟或處理步驟的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠具有其他實(shí)施方案且能夠W各種方式 實(shí)施或進(jìn)行。
[0014] 在本說明書全篇中提及"一個(gè)實(shí)施方案"、"某些實(shí)施方案"、"一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方 案"或"實(shí)施方案"意味著結(jié)合所述實(shí)施方案描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或特性包括于本發(fā) 明的至少一個(gè)實(shí)施方案中。因此，在本說明書全篇中各個(gè)地方出現(xiàn)如"在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方 案中"、"在某些實(shí)施方案中"、"在一個(gè)實(shí)施方案中"或"在實(shí)施方案中"的短語未必指本發(fā)明 的同一實(shí)施方案。此外，具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或特性可W任何適合方式在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施 方案中加W組合。
[001引在第一方面中，本發(fā)明設(shè)及用于將嵌入的活性劑遞送至細(xì)胞或組織的合成DNA載 體，其中DNA是全部或部分雙鏈，并且DNA載體包含嵌入在DNA的雙鏈部分中的活性劑。合 成DNA載體的寡核巧酸組分可W是線性或分支的寡核巧酸。DNA載體的每個(gè)雙鏈DNA部分 的長(zhǎng)度為5個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，例如約20-35個(gè)堿基對(duì)、約35-50個(gè)堿基對(duì)、約50-100個(gè)堿基 對(duì)或約100-200個(gè)堿基對(duì)。合成DNA載體在體外被構(gòu)建，并且優(yōu)選包含多個(gè)雙鏈部分W增加 活性劑的負(fù)載。包含多個(gè)雙鏈部分的合成DNA載體的實(shí)例包括DNA樹枝狀聚合物。如果合 成DNA載體包含線性寡核巧酸，則寡核巧酸可W包含單個(gè)雙鏈部分或多個(gè)雙鏈部分。DNA載 體中的所述線性寡核巧酸的總長(zhǎng)度通常為至少10個(gè)核巧酸，例如長(zhǎng)度為10-20個(gè)核巧酸、 10-50個(gè)核巧酸、10-80個(gè)核巧酸、10-150個(gè)核巧酸或10-200個(gè)核巧酸。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，合成DNA載體還可W包含結(jié)合選擇的細(xì)胞或組織類型的祀向 劑W使DNA載體結(jié)合至選擇的細(xì)胞或組織類型，從而促進(jìn)活性劑向選擇的細(xì)胞或組織類型 的遞送。通過使祀向劑結(jié)合至細(xì)胞表面蛋白或細(xì)胞表面受體，可W使祀向劑結(jié)合至選擇的 細(xì)胞或組織類型。適合的祀向劑包括結(jié)合細(xì)胞表面蛋白或細(xì)胞表面受體的抗體、配體或膚。 祀向劑通常共價(jià)或非共價(jià)連接至DNA樹枝狀聚合物臂（例如，祀向劑連接至互補(bǔ)于樹枝狀 聚合物臂并且與樹枝狀聚合物臂雜交的寡核巧酸）。
[0017] 可W由祀向劑祀向的細(xì)胞表面受體和蛋白質(zhì)的實(shí)例包括轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR/ CD71)、HIV-I包膜糖蛋白巧nv)、追疾抗原標(biāo)記W及葉酸受體。優(yōu)選地，細(xì)胞表面受體或蛋 白質(zhì)在感染的、受損的或患病的細(xì)胞上特異性表達(dá)，或在感染的、受損的或患病的細(xì)胞上過 表達(dá)。祀向劑的具體實(shí)例包括抗轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體或TfR-祀向膚，如結(jié)合在各種癌癥中過表達(dá) 的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的THRPPMWSPVWP(SEQIDNO: 1)。例如，祀向劑還可W是G8單克隆抗體，所 述G8單克隆抗體結(jié)合存在于Myo/Nog細(xì)胞和它們的衍生物的表面上的大約170kDa的蛋白 質(zhì)。Myo/Nog細(xì)胞通過用于骨骼肌特異性轉(zhuǎn)錄因子MyoD、骨形態(tài)發(fā)生蛋白度M巧抑制劑頭 蛋白W及細(xì)胞表面G8表位的mRNA表達(dá)來鑒定。有用的祀向部分的其他實(shí)例包括結(jié)合PDGF 受體、EGFR家族受體、ICAM、CD受體、MMP-9、白細(xì)胞介素受體、葉酸受體W及本領(lǐng)域中已知 的其他受體的那些祀向部分。
[0018] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌入在DNA載體的雙鏈部分中的活性劑是化療劑、抗感染 劑、抗追疾劑W及抗病毒劑或抗真菌劑。所述試劑的具體實(shí)例包括黃連素化erberine) (抗真菌的、抗瘤的）、叮晚（例如，普羅黃素（proflavine)或奎納克林（quinacrine)， 抗菌的）、癌癥化療劑（例如，道諾霉素（daunomycin)、阿霉素（doxorubicin)、柔紅霉素 (daunorubicin)、更生霉素（dactinomycin)Jll員銷