包含透明質(zhì)酸的藥物組合物用于治療黑椎間盤疾病的制作方法
【專利說明】包含透明質(zhì)酸的藥物組合物用于治療黑椎間盤疾病發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及水凝膠形式的藥物組合物，其用于治療椎間盤變性，特別是髓核的脫水和空洞化形式，稱為“黑椎間盤疾病(black disc disease)”。
技術(shù)背景
[0002]通用術(shù)語“背痛”包括廣泛的障礙，其定義通常是不確定的，并且其病因?qū)W難以分類，特征在于共有的癥狀:“背痛”。脊柱的腰骶部是至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)；在所有的過渡樞紐中，它是確定承受最大壓力的部分，但是也是最活動的，這使得它暴露于連續(xù)的超負(fù)荷和失衡。脊柱的關(guān)鍵點(diǎn)是椎間盤。它包含在所有類型的椎骨之中，并且包括兩個同軸亞結(jié)構(gòu):夕卜部的纖維環(huán)，它圍繞著內(nèi)部的髓核。纖維環(huán)是分層的彈性組織，由以之字形模式(即沒有垂直方向)排列的富含一系列蛋白纖維(主要是II型膠原)的細(xì)胞外基質(zhì)組成。具體地，所述的環(huán)外部由I型膠原纖維(稱為Sharpey’s纖維)組成，而中心部分由II型膠原和軟骨細(xì)胞組成。髓核是凝膠狀組織，主要由水(健康年輕人中約為85%體積)組成，被蛋白聚糖基質(zhì)(主要由透明質(zhì)酸鹽、軟骨素和硫酸角質(zhì)素組成)吸收，由位于纖維環(huán)最內(nèi)層部分的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生。髓核充當(dāng)支承部分，其支持和分散脊柱連續(xù)承受的壓力；纖維環(huán)支持拉力并且提供機(jī)械支持以及脊柱的穩(wěn)定性。椎間盤是無血管結(jié)構(gòu)，其從供應(yīng)相鄰骨結(jié)構(gòu)的血管中獲取營養(yǎng)。
[0003]由于輕傷或更簡單的老化，特別是腰骶部，椎間盤經(jīng)受結(jié)構(gòu)修飾，從而出現(xiàn)障礙，稱為“椎間盤變性”(Yong-Soo, Asian Spine Journal, 2009，3，39-44)。它涉及一套復(fù)雜的現(xiàn)象，其病因?qū)W不總是同樣的，并且具有不同的臨床特征。它包括年輕人中發(fā)現(xiàn)的無癥狀變性和特別疼痛形式，并發(fā)明顯的姿勢變化。后者通常(但不總是)發(fā)生在老年人中，并且可以由創(chuàng)傷、磨損、營養(yǎng)不良或簡單地由(如所述的)組成椎間盤的結(jié)構(gòu)老化引起。多種形式的椎間盤變性包括一個特征:水含量減少，導(dǎo)致組成髓核的蛋白質(zhì)和蛋白聚糖的減少以及結(jié)構(gòu)修飾；它變得脫水、空洞化并且失去它的凝膠狀結(jié)構(gòu)和與纖維環(huán)的清晰界限。椎間盤的變性改變在NMR掃描中清晰可見；它出現(xiàn)比健康椎間盤整體變薄，并且表現(xiàn)出顏色變化，變成不同深淺的黑色，這是由于髓核水含量的減少。這種病理學(xué)情況稱為黑椎間盤疾病。吸收震動并且提供脊柱穩(wěn)定性的椎間盤的變薄以及能力降低幾乎常常伴隨炎性因子的釋放，其產(chǎn)生劇烈疼痛(Rengachary 等人，Neurosurg Focus, 2002, 13, E14)。
[0004]在椎間盤疾病的后續(xù)階段，髓核還可能壓迫纖維環(huán)(“腫脹”)，其可能破裂，產(chǎn)生疝氣。
[0005]在不嚴(yán)重的病例中，采取保守方法，基于物理治療和疼痛控制，因為疼痛是非常急性的且讓人失去能力。由于經(jīng)典的止痛藥具有很小或無作用，通過注射施用臭氧治療被成功使用一段時間；這種療法利用臭氧有效的抗氧化、抗炎，從而止痛作用。
[0006]在最嚴(yán)重的病例中，除了疼痛控制之外，尋找從功能觀點(diǎn)看是有效的并且治療黑椎間盤疾病的策略，即至少部分減少病因并且恢復(fù)髓核結(jié)構(gòu)和功能的策略。在大多數(shù)病例中，黑椎間盤疾病伴隨姿勢缺陷，其反過來產(chǎn)生進(jìn)一步的僵硬和疼痛。
[0007]—種方法是向髓核中施用能產(chǎn)生蛋白聚糖基質(zhì)的細(xì)胞，例如來自骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞，可能的話組合通過殘留細(xì)胞促進(jìn)基質(zhì)形成的分子(例如生長因子)和炎性細(xì)胞因子抑制劑。這種方法試圖恢復(fù)蛋白聚糖基質(zhì)并且控制疼痛。
[0008]然而，這些治療仍是試驗性的，需要徹底驗證，因為它們特別是有疑問的(例如關(guān)于所用細(xì)胞的數(shù)量、活性物質(zhì)和它們的濃度以及載體的類型)。然而，向髓核施用細(xì)胞的有效性仍有爭議；如先前所述，這種結(jié)構(gòu)最初不包含細(xì)胞，并且是無血管，其意味著引入的細(xì)胞的增殖取決于周圍結(jié)構(gòu)的血液供給，確信的是其在病理學(xué)情況下是受損的。
[0009]這樣一種技術(shù)更有前途:所述的技術(shù)涉及向髓核引入“支承部分”，其能吸收并且分散壓力，從而恢復(fù)類似于生理條件的條件。
[0010]申請人發(fā)現(xiàn)并且證實(shí)由具有下列特征的水凝膠組成的“支承部分”特別適合于這種類型的應(yīng)用:
[0011].它可以通過最小的侵入植入，優(yōu)選注射技術(shù)，從而易于擠出；
[0012].它留在原位，沒有從植入部位滑出，因為它具有精確的流變學(xué)特征；
[0013].它具有機(jī)械特性(彈性、可壓縮性)，適合于支持和重新分散壓力；
[0014].它是高度可水合的；
[0015].它是絕對安全的，包括它的未修飾形式和降解產(chǎn)物，所述的降解產(chǎn)物不可避免地來源于生理學(xué)酶活性。
[0016]水凝膠(它的功效由申請人在下面證明)由透明質(zhì)酸衍生物組成。透明質(zhì)酸(HA)是線性鏈狀雜多糖，由D-葡糖醛酸和N-乙?；?D-葡萄胺的交替殘基組成。它天然存在于細(xì)胞外周凝膠中、脊椎動物的結(jié)締組織的基質(zhì)中(其中它是主要組分)、關(guān)節(jié)的滑液中以及玻璃體液和臍帶中。因此HA在生物有機(jī)體中發(fā)揮重要作用，既作為很多組織細(xì)胞的機(jī)械支持，例如皮膚、腱、肌肉和軟骨，又作為粘性液體，吸收震動并且確保關(guān)節(jié)表面可以滑越另一個。
[0017]天然的透明質(zhì)酸具有極可變的平均分子量(Mff)，取決于獲得的來源和所用的制備方法，范圍在50至13 X 16Da0
[0018]應(yīng)當(dāng)注意的是，本文的“平均分子量”意指重量平均分子量，通過“內(nèi)在粘度”法計算(Terbojevich 等人,Carbohydr Res, 1986, 363-377)。
[0019]HA的一個基本特征是從化學(xué)觀點(diǎn)看它可以進(jìn)行多種修飾，改變它的流變學(xué)和機(jī)械特征，同時保持它的生物學(xué)特征不變。
[0020]申請人驚訝地發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)已知的很多HA衍生物(酯、N-和O-硫酸化衍生物，內(nèi)酯等)中，最適合于本文描述的應(yīng)用的是通過在葡糖醛酸殘基的羧基和十六烷胺之間形成酰胺鍵獲得的那些。申請人還證明通過與黑椎間盤疾病通常所用的臭氧治療相比，這些衍生物不僅引起疼痛癥狀的顯著減少，而且產(chǎn)生完全未預(yù)見的功能改善。
[0021]發(fā)明詳述
[0022]本發(fā)明涉及水凝膠形式的藥物組合物，其用于治療椎間盤變性，特別是髓核脫水和空洞化形式，稱為“黑椎間盤疾病”。特別是本發(fā)明的藥物組合物在治療黑椎間盤疾病的疼痛治療中以及在矯正與黑椎間盤疾病相關(guān)的骨盆投射角(incidence angle)和姿勢變化所需的治療中是有效的。
[0023]所述的組合物包含透明質(zhì)酸衍生物，其形成具有精確流變特征的水凝膠，這使得其成為填充髓核的理想物質(zhì)。特別是，所用的HA衍生物是十六烷基酰胺。
[0024]如先前所述，HA的Mff范圍可以為50至13X 106Da。本發(fā)明所用的HA可以是任何來源的，例如從雞冠(EP138572)提取、發(fā)酵(來自馬鏈球菌(Streptococcus equi)或獸疫鏈球菌(zooepidemicus)，EP716688)或生物合成(來自芽孢桿菌屬(Bacillus),W02012032153、WO 2012032154)，并且重量平均分子量范圍400至3X 16Da,特別是15Da至16Da,并且甚至更特別是500，000至730，OOODa0
[0025]本發(fā)明所用的酰胺衍生物是由后者級分制備的。
[0026]透明質(zhì)酸酰胺是技術(shù)人員已知的；例如，EP1095064中公開的大量透明質(zhì)酸酰胺
(芐基、辛基、十二烷基等)的制備。
[0027]僅僅如下面描述制備的十六烷基酰胺是根據(jù)本發(fā)明使用的。簡而言之，將預(yù)先衍生化成四丁基銨鹽(TBA)的透明質(zhì)酸溶于二甲亞砜(DMSO)中，并且向產(chǎn)生的溶液中加入甲磺酸。然后加入羰基二咪唑，并且將混合物在攪拌下在室溫反應(yīng)I小時。然后加入十六烷基胺，并且將混合物在40° -42°C反應(yīng)約16-24小時。然后加入NaCl飽和溶液終止反應(yīng)，并且加入無水乙醇，通過沉淀分離衍生物。沉淀物先用水和乙醇混合物洗滌，