菝葜皂苷元3位羥基甲酰酯在制備治療宮頸炎藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為菝葜皂苷元3位羥基甲酰酯制備治療宮頸炎藥 物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥知母為百合科（Liliaceae)植物知母（Anemarrhena asphodeloides)的干燥 根莖，具有清熱瀉火、生津潤燥之功效，為中藥常用的滋陰藥之一。臨床用于外感熱病，高熱 煩渴，肺熱燥咳，骨蒸潮熱，內(nèi)熱消渴，腸燥便秘等癥狀。知母皂苷及其苷元為其有效成分之 一，近年來藥學(xué)工作者對知母皂苷及其苷元進(jìn)行了多項(xiàng)藥理研究，用于治療老年性癡呆具 有很好的前景。知母皂苷是中藥知母中有效成分之一，含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為6%，知母皂苷元 是知母皂苷類成分水解后去掉結(jié)合糖基的產(chǎn)物，同時(shí)在植物中大量存在。本發(fā)明采用萃取、 水解、重結(jié)晶等方法分離、富集得到純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96. 3%的菝葜皂苷元，并通過?；磻?yīng) 合成菝葜皂苷元3位羥基甲酰酯化產(chǎn)物。并且首次發(fā)現(xiàn)菝葜皂苷元3位羥基甲酰酯化產(chǎn)物 具有抗宮頸炎的活性。
[0004] 菝葜皂苷元3位羥基甲酰酯化產(chǎn)物

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質(zhì)是研究和發(fā)現(xiàn)新藥的先導(dǎo)化合物， 是開發(fā)新藥的天然寶庫，從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)并進(jìn)行合理的結(jié)構(gòu)修飾，開發(fā)成安全 性好、毒性低的新藥具有重要應(yīng)用價(jià)值和廣闊發(fā)展前景。
[0006] 菝葜皂苷元3位羥基甲酰酯在制備治療宮頸炎藥物中的應(yīng)用
[0007] 本發(fā)明菝葜皂苷元3位羥基甲酰酯可以制備成片劑、膠囊劑、顆粒劑、沖劑、散劑、 丸劑、口服液、糖漿劑、混懸劑、噴霧劑、溶液、湯劑、凝膠劑、霜劑、乳膏劑、滴劑等。在上述制 劑中，有效劑量的本發(fā)明提取物可以單獨(dú)或與藥學(xué)尚可接受的載體：賦形劑、崩解劑、潤滑 劑、著色劑等組成混合物。
[0008] 有益效果
[0009] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)菝葜皂苷元3位羥基甲酰酯具有良好治療宮頸炎作用，并且呈劑 量依賴關(guān)系，為進(jìn)一步研究新藥提供基礎(chǔ)。為婦科治療提供新的選擇。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 實(shí)施例1
[0011] 取干燥的知母根莖5kg，體積分?jǐn)?shù)為60 %的乙醇回流提取3次（每次2h)，提取液 合并、減壓濃縮至一定體積，經(jīng)正丁醇萃取，萃取液合并，用體積分?jǐn)?shù)為20 %的醋酸加熱水 解6h，放冷，抽濾，得到固體，通過氯仿一甲醇重結(jié)晶得到白色針狀結(jié)晶50g，此單體化合物 為菝葜阜苷元（sarsasapogenin)。
[0012] 在氬氣保護(hù)下將1.0g(2.4mmol)自制菝葜皂苷元溶入重蒸干燥吡啶中，然后將 體積分?jǐn)?shù)為70%的甲酸在冰浴溫度下滴加至上述吡啶溶液中，滴加完畢后室溫?cái)嚢?。減 壓蒸出吡啶，向剩余物中加入水，乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相l(xiāng)mol. L 1的氫氧化鈉水洗，飽 和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥過夜后，蒸出溶劑。柱色譜分離，以石油醚-丙酮梯度（體 積比為100 : 5~100 : 30)洗脫得到甲酯衍生化的菝葜皂苷元0.88g、收率為80%。 白色無定形粉末，正ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 445. 1[M+H]+。13C-NMR(300MHz， CDC13) S :l〇9.9(C-22)、81. 1(C-16)、71. 1(C-3)、65.3(C-26)、62.2(C-17)、56.5(C-14)、 42. 2 (C-20)、42. 2 (C-20)、40. 8 (C-13)、40. 3 (C-12)、40.1 (C-9)、37. 3 (C-5)、35. 4 (C-8)、 35. I (C-10)、31. 8(C-15)、30. 7(C-1)、30. 7(C-4)、27. 2(C-25)、26. 4(C-6)、26. 4(C-7)、 26. 0(C-23)、25. 9(C-24)、25. I (C-2)、23. 9(C-19)、20. 9(C-11)、16. 6(C-18)、16. I (C-27)、 14. 3(C-21)、161. 0(0 = C-0)。
[0014] 菝葜皂苷元3位羥基甲酰酯化產(chǎn)物
[0015] 實(shí)施例2
[0016] 1、樣品（實(shí)施例1獲得菝葜皂苷元3位羥基甲酰酯化產(chǎn)物）對白介素IP (IL-10) 誘導(dǎo)大鼠宮頸鱗狀上皮細(xì)胞炎癥的影響：
[0017] 大鼠宮頸鱗狀上皮細(xì)胞（RCEC)細(xì)胞分離和培養(yǎng)：處死大鼠，取宮頸部位的組織剪 成1~2mm3的小塊，用無菌Hank's平衡液（含15mmol. L 1HEPES,青霉素IOOkU. L \鏈霉素 IOOmg. L \ 二性霉素 0? 25mg. L-l，pH 7. 4)洗滌 3 次，0? 1%膠原酶（189kU. L 3 在 37°C消化 50分鐘，然后用0. 2%胰蛋白酶37°C消化20分鐘，Hank's平衡液洗滌兩次，用生長培養(yǎng)基 懸浮，將來動物宮頸的組織接種于60mm培養(yǎng)皿中，在34°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。生長培 養(yǎng)基為A與B (1 :1)兩部分組成，A與B成分如下：
[0018] (A) 24小時(shí)條件培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基（含10% FBS)培養(yǎng)Swiss 3T3細(xì)胞24小時(shí) 后的培養(yǎng)基；
[0019] (B)宮頸上皮細(xì)胞培養(yǎng)基（cervical epithelial growth medium，CEGM):由 HamF12和RPMI-1640 (1:1)組成，再添加7. 5 %豬血清、胰島素（10 y g. L ^、轉(zhuǎn)鐵蛋白 (lOmg. L 3、氫化可的松（6. 5mg. L 3、霍亂毒素（0. lnmol. L i、牛腦提取物（150mg. L 3，
[0020] 3天后，棄去培養(yǎng)基，用D-Hanks輕輕漂洗除去組織碎片。然后加入CEGM培養(yǎng)， 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到融合后，先用D-Hanks漂洗1小時(shí)，然后加入0.025 %胰蛋白酶與0.5mmol. L-1EDTA(1:1)消化，用CEGM重新懸浮，然后接種到預(yù)先鋪有膠原凝膠的IOOmm培養(yǎng)皿上。 此二代培養(yǎng)物可以傳代，先添加0. 1 %膠原酶0. 005L在34°C孵育直到膠原完全液化（約1 小時(shí)），用D-Hanks洗滌細(xì)胞懸液，再用0. 025%胰蛋白酶與0. 5mmol. L 1EDTAd : 1)在37°C 消化10分鐘，細(xì)胞懸液經(jīng)洗滌后重新懸浮在CEGM中，接種于預(yù)先鋪有膠原凝膠的培養(yǎng)板， 實(shí)驗(yàn)用第2~3代細(xì)胞。臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞活率大于95%，細(xì)胞純度鑒定采用免疫組化SABC 法，將生長有細(xì)胞的蓋玻片從培養(yǎng)板中取出，丙酮固定，以小鼠抗大鼠細(xì)胞角蛋白多抗為一 抗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB)顯色，胞漿被染成棕黃色者為陽性，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)立陰性對照。顯微 鏡下觀察顯色結(jié)果，細(xì)胞陽性率達(dá)95%以上。
[0021] (2)細(xì)胞分組和處理
[0022] 將細(xì)胞懸液調(diào)到IXlO9. 1 \接種于2孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)液不含小牛血清。以每 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔為一樣本個(gè)體，隨機(jī)分為正常對照組、炎疰對照組，樣品〇, 〇1，〇. 1，1. 〇和 10, Ong. ml 1組，每種處理設(shè)3個(gè)復(fù)孔。樣品組分別加入樣品至終濃度0. 01，0. 1，I. 0和 10.0 ng. ml \正常對照組和炎癥對照組添加培養(yǎng)液，置34°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí) 后，炎癥對照組和樣品組加入終濃度為5ng. ml-1的IL-I P，置34°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6小時(shí)。分別收集每組上清液用放射免疫分析法分別測定IL-8和PGE2含量。此試驗(yàn)重復(fù) 2次。
[0023] 結(jié)果：
[0024] 表1對大鼠宮頸鱗狀上皮細(xì)胞分泌IL-8和PEG2的作用
[0026] 與炎癥對照組相比，#p〈0. 01，*p〈0. 05
[0027] 討論本發(fā)明樣品組藥效呈劑量依賴關(guān)系，并且在高劑量下樣品組與正常組無顯著 性差異。證明其在具有良好治療效果。
[0028] 2、樣品對實(shí)驗(yàn)性大鼠子宮頸炎的治療作用：
[0029] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0030] 樣品（實(shí)施例1)栓劑的制備：將IOOmg卡波普浸泡于注射用水中，充分溶脹，加入 聚山梨醇20mg，攪拌均勾，加入用乙醇溶解的25mg樣品，充分混勾加水至IOmL即得
[0031] 1)大鼠子宮頸炎模型的建立：制備大鼠子宮頸炎模型：用阿拉伯樹膠將苯酚混懸 制備25%苯酚膠漿，向造模大鼠陰道深部注入0. 4ml，三天一次，共三次。大鼠由南京青龍 山實(shí)驗(yàn)動物中心。
[0032] 2)分組及處理
[0033] 將大鼠隨機(jī)分為分組：每組6只。造模后第三天，開始陰道局部給藥，連續(xù)12天。 樣品治療組分別給樣品2、4和8mg. kg \ d i。陽性對照組給聚甲酚磺醛5mg-kg \ d \陰性 對照組給空白基質(zhì)栓劑。
[0034] 3)子宮頸組織病理形態(tài)學(xué)觀察
[0035] 末次給藥后24天處死動物，解剖取材陰道至子宮角處組織，用10%福爾馬林固 定，石蠟包埋，切片，HE染色。每個(gè)樣本選取相同部位的同一張石蠟切片，在顯微鏡下觀察 子宮頸部位的粘膜及其粘膜下間質(zhì)的病理形態(tài)學(xué)變化。隨機(jī)選取非重疊的3個(gè)視野，采用 計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析炎性細(xì)胞數(shù)量等。
[0036] 病理形態(tài)學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0037] 粘膜：鱗狀上皮層次僅局部超過2-3層略有增厚為"+，'，明顯增厚為"++，'，廣泛 增厚并使粘膜凹凸不平為"+++，' ：有些處柱狀上皮可見有增生而出現(xiàn)鱗化趨勢為" + "，明顯 鱗化為"++"，鱗化區(qū)域廣泛甚至達(dá)宮腔為"+++，' ：僅見極少區(qū)域鱗狀上皮出現(xiàn)糜爛而被鄰 近柱狀上皮增生替代為" + "，柱狀上皮增坐明顯替代鱗狀上皮為"++"，鱗狀上皮大片脫落 由柱狀上皮替代為"+++";僅見極少區(qū)域糜爛突破基底膜為"+，'，可見明顯粘膜上皮變性壞 死為"++"，粘膜潰瘍伴有感染為"+++"。
[0038] 炎細(xì)胞浸潤：僅見粘膜及粘膜下淺層有少量炎細(xì)胞浸潤為" + "，粘膜及粘膜下 間質(zhì)內(nèi)均有中等量炎細(xì)胞浸潤為"++"，粘膜下及間質(zhì)內(nèi)深層均見大量廣泛炎細(xì)胞浸潤為 "+++"。
[0039] 間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生：間質(zhì)內(nèi)僅見成纖維細(xì)胞略較正常對照組增多為"+，'，成纖 維細(xì)胞增生明顯并有少量膠原纖維束為"++，'，成纖維細(xì)胞增生伴有大量膠原纖維束形成 為 "+++，'。
[0040] 綜合宮頸總體病理改變程度分為如下4級：正常：六項(xiàng)中僅見淺層少量炎細(xì)胞浸 潤；輕度：六項(xiàng)中兩項(xiàng)以上" + "；中度：六項(xiàng)中兩項(xiàng)以上" + "，兩項(xiàng)有"++，'；重度：六項(xiàng)中一 項(xiàng)有"+++"，兩項(xiàng)有"++，'，三項(xiàng)有" + "；或三項(xiàng)有"+++"。
[0041] 結(jié)果
[0042] 1.子宮頸組織病理形態(tài)學(xué)觀察
[0043] 造模大鼠子宮頸組織大量炎性細(xì)胞浸潤，可見上皮糜爛與粘膜潰瘍，并有糜爛部 位柱狀上皮替代鱗狀上皮的趨勢。粘膜下層毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，間質(zhì)水腫，從粘膜至間質(zhì)均 可見大量炎性細(xì)胞浸潤，并可見間質(zhì)纖維組織增生。樣品2、4和8mg. kg-1治療組與陰性對 照組相應(yīng)部位比較，粘膜下炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，其中8mg. kg-1治療組的細(xì)胞形態(tài)與組 織結(jié)構(gòu)更接近正常對照組。結(jié)果見表2、3。
[0044] 表2對實(shí)驗(yàn)性宮頸炎大鼠宮頸病理形態(tài)學(xué)變化的影響
[0045]
[0046] 表3對實(shí)驗(yàn)性宮頸炎大鼠宮頸組織炎癥細(xì)胞數(shù)的影響
[0047]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 菝皂苷元3位羥基甲酰酯在制備治療宮頸炎藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菝皂苷元3位羥基甲酰酯在制備治療宮頸炎藥物中的應(yīng)用， 其特征在于所述的菝葜皂苷元3位羥基甲酰酯制備成片劑、膠囊劑、顆粒劑、沖劑、散劑、丸 劑、口服液、糖漿劑、混懸劑、噴霧劑、溶液、湯劑、凝膠劑、霜劑、乳膏劑、滴劑等。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的菝皂苷元3位羥基甲酰酯在制備治療宮頸炎藥物中的應(yīng)用， 其特征所述的在所述的制劑中，有效劑量的菝皂苷元3位羥基甲酰酯可以單獨(dú)或與藥學(xué)尚 可接受的載體：賦形劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑等組成混合物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為菝葜皂苷元3位羥基甲酰酯制備治療宮頸炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)菝葜皂苷元3位羥基甲酰酯具有良好治療宮頸炎作用，并且呈劑量依賴關(guān)系，為進(jìn)一步研究新藥提供基礎(chǔ)。為婦科治療提供新的選擇。
【IPC分類】A61P29/00, A61P15/00, A61K31/58
【公開號】CN105193825
【申請?zhí)枴緾N201510672267
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年10月18日