黑果枸杞果實提取物在制藥中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種黑果枸杞果實提取物的新用途，具體涉及在制備治療干燥綜合征 藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 干燥綜合征（Sj6grert'ssyndrome, SS)是一種主要侵犯外分泌腺的慢性系統(tǒng)性自 身免疫性疾病。該病最常見的臨床表現(xiàn)為進行性口干、眼干，同時可累及腎、肺、甲狀腺和肝 等多種器官，出現(xiàn)高球蛋白性紫癜、間質性肺炎、腎小管酸中毒、膽汁性肝硬化、外周及中樞 神經損傷等表現(xiàn)。本病分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，不合并其他自身免疫性疾病者稱為原發(fā) 性干燥綜合征（primary SS，pSS);繼發(fā)于類風濕關節(jié)炎（RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)等為 繼發(fā)性干燥綜合征（secondary SS，sSS)。SS女性多發(fā)，約占全部病例的90%，發(fā)病年齡集 中于30~60歲。流行病學調查顯示，該病在我國人群患病率為0. 29%~0. 77%，在老年 群體中患病率為3%~4%。是最常見的結締組織病之一，目前尚無肯定的藥物改變其病程 (華紅，干燥綜合征西醫(yī)、中醫(yī)治療研究進展，中國實用口腔科雜志，2012, 5 (3)，142-145.)。
[0003] 干燥綜合征的病理機制尚不明確，多種動物模型被用來研究干燥綜合征的病理 過程，其中NOD小鼠模型被認為目前比較適宜的干燥綜合征動物模型（高春鶴，劉維.干 燥綜合征NOD小鼠模型研究進展，中國實驗動物學報，2008, 16 (1)，65-69)。水分子通道蛋 白-5 (AQP5)是細胞跨膜轉運蛋白之一，具有高通透性，通過此通道水可以經過質膜向高滲 方向快速移動。在SS的發(fā)病機制中，目前只有AQP5證實與唾液分泌功能密切相關。AQP5 在SS涎腺及淚腺組織定位明確，其轉運分布的異常，均能導致腺體破壞及M3R的異常，引起 口眼干等癥狀。故可以通過AQP5途徑刺激增加腺體分泌，改善SS 口干等癥狀，達到治療SS 的目的（劉燕，錢先.AQP5在干燥綜合征發(fā)病機制中作用研究進展，遼寧中醫(yī)藥大學學報， 2014,16(1)，85-87)。
[0004] 黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.)系爺科枸杞屬多年生耐鹽抗旱灌木植物， 主要生長于我國西北高原地區(qū)的鹽堿荒漠地帶，藏藥稱其果實為"旁瑪"，據《四部醫(yī)典》和 《晶珠本草》等藏醫(yī)藥經典著作記載，可用于治療心熱病、心臟病、月經不調和停經等病癥。 天然花青素類化合物由于可清除人體內代謝過程中產生的過多自由基，具有較強的防止活 性氧危害及抗氧化活性，對于疾病的防治起著重要作用。
[0005] 目前還沒有文獻關于黑果枸杞果實及其提取物用于治療干燥綜合征的報道。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是公開一種黑果枸杞果實提取物在制藥中的應用，以滿足臨床應用 的需要。
[0007] 動物試驗證明，所述的黑果枸杞果實提取物，對于所述的干燥綜合征具有明顯的 治療和改善效果，可以用于制備治療干燥綜合征藥物。
[0008] 所述的黑果枸杞果實提取物，可以根據我們此前申請的專利（專利名稱：黑果枸 杞果實提取物及制備方法和應用，【申請?zhí)枴?01310274771. 5)所公開的技術進行制備，具體 的包括如下步驟：
[0009] (1)提取：將黑果枸杞果實，加入重量濃度為1~2%。酸的水溶液，溫度10~60°C 攪拌提取，提取時間為1~3小時，優(yōu)選提取1~3次，每次0. 5~1小時，過濾收集提取 液；
[0010] 酸的水溶液的重量用量為黑果枸杞果實的8~12倍；
[0011] 所述的酸選自鹽酸、醋酸、甲酸、檸檬酸、草酸或磷酸；
[0012] (2)吸附：將步驟（1)中得到的提取液，通過裝有聚苯乙烯一二乙烯苯大孔樹脂的 層析柱，使黑果枸杞果實提取液得到選擇性充分吸附；
[0013] (3)洗脫：先用水洗脫步驟（2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱，直至洗脫 液為中性或檢測無糖反應，再用洗脫液洗脫，收集層析柱流出的洗脫液；
[0014] 所述洗脫液由如下重量百分比的組分組成：
[0015] 酸 0? 1 ~2%〇
[0016] 體積濃度為75 %的乙醇水溶液 余量
[0017] 洗脫液的重量用量為步驟（1)中黑果枸杞果實重量的15~20倍；
[0018] 所述的酸為鹽酸、醋酸或檸檬酸；
[0019] (4)濃縮：將步驟（3)中所得洗脫液于50~60°C條件下減壓濃縮回收乙醇，直至 25°C時的溶液密度為I. 1~1. 2,得黑果枸杞果實提取物浸膏；
[0020] (5)干燥：將步驟（4)中所得黑果枸杞果實提取物浸膏進行冷凍干燥，獲得所述黑 果枸杞果實提取物。
[0021] 上述的黑果枸杞果實提取物，含有：矮牽牛單寧（petanin)的重量含量為14%~ 18% 〇
[0022] 結構式如下：
[0023]
[0024] 優(yōu)選的，是采用包括如下步驟的方法制備的：
[0025] (1)提取：將黑果枸杞果實，加入重量濃度為2%。鹽酸的水溶液，在溫度60°C攪拌 提取三次，每次0. 5小時，過濾收集提取液；
[0026] 鹽酸的水溶液的重量用量為黑果枸杞果實的8倍；
[0027] (2)吸附：將步驟⑴中得到的提取液，通過裝有聚苯乙烯一二乙烯苯大孔樹脂的 層析柱，使黑果枸杞果實提取液得到選擇性吸附；
[0028] (3)洗脫：先用水洗脫步驟（2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱，直至洗脫 液為中性或檢測無糖反應，再用洗脫液洗脫，收集層析柱流出的洗脫液；
[0029] 洗脫液由如下重量百分比的組分組成：
[0030] 酸 2%〇
[0031 ] 體積濃度為75 %的乙醇水溶液 余量
[0032] 洗脫液的重量用量為步驟（1)中黑果果實的20倍；
[0033] 所述的酸為鹽酸；
[0034] (4)濃縮：將步驟⑶中所得洗脫液于60°C條件下減壓濃縮回收乙醇，直至25°C 時的溶液密度為1. 1，得黑果枸杞果實提取物浸膏；
[0035] (5)干燥：將步驟⑷中所得黑果枸杞果實提取物浸膏進行冷凍干燥，獲得黑果枸 杞果實提取物；其中：矮牽牛單寧（petanin)的重量含量為16. 33%。
[0036] 進一步優(yōu)選的，是采用包括如下步驟的方法制備的：
[0037] (1)提?。簩⒑诠坭焦麑崳尤胫亓繚舛葹?%。檸檬酸的水溶液，在溫度KTC攪 拌提取三次，每次1小時，過濾收集提取液；
[0038] 酸的水溶液的重量用量為黑果枸杞果實的12倍；
[0039] (2)吸附：將步驟⑴中得到的提取液，通過裝有聚苯乙烯一二乙烯苯大孔樹脂的 層析柱，使黑果枸杞提取液得到選擇性吸附；
[0040] (3)洗脫：先用水洗脫步驟（2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱，直至洗脫 液為中性或檢測無糖反應，再用洗脫液洗脫，收集層析柱流出的洗脫液；
[0041] 洗脫液由如下重量百分比的組分組成：
[0042] 酸 0? 1%0
[0043] 體積濃度為75 %的乙醇水溶液 余量
[0044] 洗脫液的重量用量為步驟（1)中黑果枸杞果實的15倍；
[0045] 所述的酸為檸檬酸；
[0046] (4)濃縮：將步驟（3)中所得洗脫液于60°C條件下減壓濃縮回收乙醇，直至25°C 時的溶液密度為1. 2,得黑果枸杞果實提取物浸膏；
[0047] (5)干燥：將步驟（4)中所得黑果枸杞果實提取物浸膏進行冷凍干燥，獲得黑果枸 杞果實提取物，其中：矮牽牛單寧的重量含量為：15. 5%。
[0048] 進一步，所述的藥物，包括治療有效量的所述的黑果枸杞果實提取物和醫(yī)藥學上 可接受的載體，所述載體如：稀釋劑、賦形劑（比如水）等，填充劑如淀粉、蔗糖、乳糖、微晶 纖維素等，粘合劑如纖維素衍生物、明膠和聚乙烯吡咯烷酮等，潤濕劑如甘油等，表面活性 劑如十六烷醇等，崩解劑如碳酸鈣、交聚維酮、羥基乙酸淀粉鈉等，潤滑劑如滑石粉、硬脂酰 富馬酸鈉、硬脂酸鈣和鎂等。
[0049] 可采用本領域公知的方法，將治療有效量的黑果枸杞果實提取物與一種或多種藥 學上可接受的載體相混合，制備成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、滴丸、軟膠 囊、口服液、注射液、針劑、乳劑（含微乳、亞微乳）、軟膏、栓劑、貼劑、巴布劑等，其中活性成 分的含量為〇? 1%~99. 5% (重量比）。
[0050] 本發(fā)明可通過口服途徑施加于需要治療的患者，劑量為50_200mg/kg/體重/天；
[0051] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有下列優(yōu)點：
[0052] 毒性試驗證明，所述黑果枸杞果實提取物毒性小鼠口服給藥5g/kg ?體重?天未 見明顯毒性，即使長期使用，也對人體無害；在申請人此前申請的專利（專利名稱：黑果枸 杞果實提取物及制備方法和應用，【申請?zhí)枴?01310274771. 5)基礎上，通過動物體內試驗， 發(fā)現(xiàn)了黑果枸杞果實提取物對干燥綜合征有顯著療效，可以用于制備治療干燥綜合征的藥 物。
【附圖說明】
[0053] 圖1?矮牽牛單寧（petanin)對照品液相圖譜。
[0054] 圖2.黑果枸杞果實提取物中矮牽牛單寧含量測定液相圖譜。
[0055] 圖3.空白溶液液相圖譜。
[0056] 圖4. AQP5免疫組化染色結果（模型對照組）
[0057] 圖5.AQP5免疫組化染色結果（HGGQ組）?
[0058] 圖 6.AQP5RT-PCR測定結果
【具體實施方式】
[0059] 實施例1
[0060] 黑果枸杞果實提取物的檢測方法
[0061] 黑果枸杞果實提取物中矮牽牛單寧（petanin)的含量測定照高效液相色譜法（中 華人民共和國藥典附錄VID)和我們此前申請的專利（【申請?zhí)枴?01310274771. 5)所公開的 測定方法測定，具體方法為：
[0062] 1 ?儀器和試藥
[0063] Waters e2695高效液相色譜儀，配Waters 2998PAD二極管陣列紫外檢測器，乙腈 為色譜純，甲酸為分析純（97%，Alfa Aesar公司），水為純凈水（娃哈哈公司）。對照品矮 牽牛單寧（petanin)為從黑果枸杞果實提取物中分離制備，其理化數(shù)據如下：
[0064] 紫紅色粉末，1H-Nmr(CD3(^CF3O)ODAI):矮牽?；ㄜ赵糠?8.89(s，H-4)，6.97(d，J= 1.5Hz，H-6)，6.98 (d，J= 1.5Hz，H-8)，7.89 (d，J= 2. 0Hz,H-2 ' ),1.73 (d,J= 2. 0Hz,H-6 ' )，3. 95 (3H，s，OMe) ;3-〇-P-葡萄糖 部分 5.51(d，J= 7.5Hz，H-l)，3.77(dd，J= 7.5,9.0Hz，H-2)，3.67(t-like，J=9. 0Hz,H-3) , 3. 53 (dd,J= 9. 0, 9. 5Hz,H-4) , 3. 89 (m,H-5) , 4. 04 (dd,J= 11.5,2.0Hz，H-6a)，3.77(dd，J= 11.5,5.8Hz，H-6b);鼠李糖部分 4.71(brs,H-l)，3 .85(brs,H-2), 3. 86(d,J= 9. 5Hz,H-3),4. 89 (t-1ike,J= 9. 5Hz,H-4),3. 78 (dd,J =9.5,6.5Hz，H-5)，1.09(d，J= 6.5Hz,H-6) ;5-0-P-葡萄糖部分 5.18(d,J= 8. 0Hz,H-l),3. 74 (m,H-2),3. 63 (m,H-3),3. 57 (m,H-4),3. 64 (m,H-5),3. 98 (d,J= 12. 0Hz, H-6a),3. 84 (dd, J = 12. 0, 6. 0Hz, H-6b);反式香豆酰部分 7. 38 (2H