用于治療碳氧血紅蛋白血癥的組合物和方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2013年6月12日提交的美國臨時申請No. 61/834,035以及2013 年3月15日提交的美國臨時申請No.61/799, 155的優(yōu)先權(quán)。上述申請通過引用的方式全 文納入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開內(nèi)容涉及重組珠蛋白分子，例如神經(jīng)珠蛋白和細胞珠蛋白的以非常高的親 和力結(jié)合一氧化碳的突變形式，及其用于治療碳氧血紅蛋白血癥和一氧化碳中毒的用途。
[0004] 政府支持的確認
[0005] 本發(fā)明是通過在由美國國立衛(wèi)生研究院授予的基金號HL 103455的政府支持來 完成的。美國政府對本發(fā)明享有某些權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0006] 對一氧化碳的吸入暴露是環(huán)境中毒的主要原因。個體可在各種環(huán)境下暴露于空氣 中的一氧化碳，例如，房屋火災(zāi)、使用一氧化碳氣體發(fā)生器（generator)或在房屋內(nèi)使用戶 外烤肉烤架，或通過在封閉空間中運行汽車來試圖自殺。一氧化碳結(jié)合細胞中的血紅蛋白 和血紅素蛋白，特別是呼吸傳遞鏈的酶。與血紅蛋白和其他血紅素蛋白結(jié)合的一氧化碳的 積累會損壞用于氧化磷酸化的氧遞送和氧利用。這最終導(dǎo)致對重要器官（例如腦和心臟） 的嚴重的低氧和局部缺血性損傷。血液中積累了大于15%的碳氧血紅蛋白的個體具有腦損 傷和神經(jīng)認知機能障礙的風(fēng)險。具有更高水平的碳氧血紅蛋白的個體具有死亡的風(fēng)險。具 有非常高的碳氧血紅蛋白水平的患者通常受到不可逆的腦損傷和腦死亡。
[0007] 盡管存在用標準動脈和靜脈血氣體分析和一氧化碳-血氧定量法（co-oximetry) 來快速診斷一氧化碳中毒的方法，并且盡管意識到了一氧化碳中毒的風(fēng)險因素，但是沒有 針對該有毒暴露的可用的解毒劑?，F(xiàn)有的療法是通過面罩釋放100 %的氧，并且在可能的情 況下使患者暴露于高壓氧。用于高壓氧療法的機制是，氧將提高一氧化碳從血紅蛋白和從 組織釋放的速率，并且加速一氧化碳的自然清除。然而，該療法對一氧化碳的清除速率僅具 有中等的（moderate)效果，并且基于高壓氧設(shè)備的復(fù)雜性，該療法在野外是不可用的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 對用于治療碳氧血紅蛋白血癥（也稱為一氧化碳中毒）的有效、快速并且容易得 到的療法存在需求。本公開內(nèi)容提供了經(jīng)修飾的珠蛋白分子，例如神經(jīng)珠蛋白或細胞珠蛋 白的以非常高的親和力結(jié)合一氧化碳的重組體形式，從而起到一氧化碳清除劑的作用。本 文公開的數(shù)據(jù)證明，所述經(jīng)修飾的珠蛋白可用于，例如從血液或組織中的血紅蛋白中移除 一氧化碳的方法，以及治療碳氧血紅蛋白血癥的方法。
[0009] 本文提供了一種治療受試者中的碳氧血紅蛋白血癥的方法，其通過選擇患有碳氧 血紅蛋白血癥的受試者并將治療有效量的以高親和力結(jié)合一氧化碳的重組珠蛋白分子給 予受試者來進行。在一些實施方案中，所述重組珠蛋白分子是具有第64位殘基處的突變 (例如H64Q、H64L、H64A或H64W突變）的重組人神經(jīng)珠蛋白，或具有第81位殘基處的突變 (例如H81Q、H81A、H81L或H81W突變）的人重組細胞珠蛋白。在一些實例中，所述重組珠 蛋白分子還包含一個或多個半胱氨酸置換，以得到提高的溶解度。提高的溶解度允許產(chǎn)生 突變珠蛋白的高儲液（stock)濃度，用于輸注足以治療碳氧血紅蛋白血癥的劑量。
[0010] 本文還提供了一種從血液或組織中的血紅蛋白中移除一氧化碳的方法，其通過使 所述血液或組織與以高親和力結(jié)合一氧化碳的重組珠蛋白分子接觸來進行。在一些實施方 案中，所述重組珠蛋白分子是具有第64位殘基處的突變（例如H64Q、H64L、H64A或H64W突 變）的重組人神經(jīng)珠蛋白，或具有第81位殘基處的突變（例如H81Q、H81A、H81L或H81W突 變）的人重組細胞珠蛋白。在一些實例中，從血紅蛋白的移除一氧化碳的所述方法是體外 方法。在另一些實例中，所述方法是體內(nèi)方法，其包括將所述重組珠蛋白分子給予需要治療 的受試者。
[0011] 本文還提供了人重組神經(jīng)珠蛋白，其包含第64位殘基處的突變，并且還包含C46G 突變、C55S突變和C120S突變。在一些實施方案中，所述第64位殘基處的突變是H64Q、 H64A、H64L或H64W突變。類似地，本公開內(nèi)容提供了人重組細胞珠蛋白，其包含第81位殘 基處的突變，并且還包含C38S突變和C83S突變。在一些實施方案中，所述第81位殘基處 的突變是H81Q、H81A、H81L或H81W突變。本公開內(nèi)容還提供了包含所述重組神經(jīng)珠蛋白或 細胞珠蛋白以及可藥用載體的組合物。
[0012] 根據(jù)以下參照附圖進行的詳細說明，本發(fā)明的前述以及其他目的、特征和優(yōu)點將 變得更加顯而易見。
【附圖說明】
[0013] 圖IA至IB是示出羧化的紅細胞（RBC)與緩沖液或脫氧神經(jīng)珠蛋白（deoxyNgb) H64Q的反應(yīng)的圖。該實驗是在厭氧條件下于PBS緩沖液中在21°C下進行。（圖1A)示出 了 RBC級分的脫氧或羧化的物質(zhì)：在RBC+Ngb實驗期間的deoxyHb (菱形）；RBC+Ngb實 驗期間的HbCO (方形）；RBC+緩沖液實驗期間的HbCO (X);以及RBC+緩沖液實驗期間的 deoxyHb (三角形）。（圖1B)示出了上清液（神經(jīng)珠蛋白）級分的脫氧或羧化的物質(zhì)：在 RBC+Ngb實驗期間的deoxyNgb (菱形）；RBC+Ngb實驗期間的NgbCO (方形）。
[0014] 圖2是示出羧化的紅細胞與deoxyNgb H64Q的反應(yīng)的圖。該實驗是在厭氧條件下 于PBS緩沖液中在21°C下進行。示出了 RBC級分的脫氧或羧化的物質(zhì)：deoxyHb(菱形）； HbCO (方形）！deoxyNgb (三角形）；和 NgbCO(X)。
[0015] 圖3是示出羧化的紅細胞與oxyNgb H64Q的反應(yīng)的圖。該實驗是在好氧條件下于 PBS緩沖液中在21°C下進行。示出了 RBC級分的脫氧或羧化的物質(zhì)：〇XyHb(方形）；HbC0(三 角形）；oxyNgb ⑴；NgbCO (星號）。
[0016] 圖4是示出CO-暴露的小鼠的血液中HbCO濃度的圖。將小鼠暴露于1500ppm C0， 持續(xù)60分鐘，然后停止C0,并輸注PBS (200 μ 1)，持續(xù)5分鐘。每5分鐘至10分鐘取血樣 (約10 μ 1)，用連二亞硫酸鹽進行化學(xué)還原并監(jiān)測HbCO。血液中的其他Hb物質(zhì)（oxyHb/ metHb/deoxyHb)被表示為脫氧Hb。
[0017] 圖5是示出CO-暴露的小鼠的血液中HbCO濃度的圖。將小鼠暴露于1500ppm C0， 持續(xù)70分鐘，然后停止C0,并輸注濃縮的H64Q Ngb (200 μ I)，持續(xù)10分鐘。每5分鐘至 10分鐘取血樣（約10 μ 1)，用連二亞硫酸鹽進行化學(xué)還原，并監(jiān)測HbCO和NgbCO。血液中 的其他Hb物質(zhì)（oxyHb/metHb/deoxyHb)被表示為脫氧Hb，并將Ngb物質(zhì)（oxyNgb/metNgb/ deoxyNgb)被表示為脫氧Ngb。
[0018] 圖6是示出CO-暴露的小鼠的血液中HbCO濃度的圖。將小鼠暴露于1500ppm C0， 持續(xù)70分鐘，然后停止C0,并輸注濃縮的H64Q Ngb (200 μ 1)，持續(xù)5分鐘。每5分鐘至10 分鐘或20分鐘取血樣（約10 μ 1)，用連二亞硫酸鹽進行化學(xué)還原，并監(jiān)測HbCO和NgbCO。 血液中的其他Hb物質(zhì)（oxyHb/metHb/deoxyHb)被表示為脫氧Hb。
[0019] 圖7A至7B是示出在PBS或H64Q神經(jīng)珠蛋白輸注后CO-暴露的小鼠的血液中 HbCO濃度衰減的一對圖。圖7A示出了絕對HbCO水平；圖7B示出了 HbCO水平的相對變 化。將小鼠暴露于1500ppm C0,，持續(xù)60分鐘至70分鐘，然后停止C0,并輸注濃縮的H64Q Ngb (200 μ 1)，持續(xù)5分鐘。輸注的時刻被標記為t = 0。每5分鐘至10分鐘取血樣（約 10 μ 1)，用連二亞硫酸鹽進行化學(xué)還原，并監(jiān)測HbCO和NgbCO。血液中的其他Hb物質(zhì) (oxyHb/metHb/deoxyHb)被表示為脫氧Hb。點表示三次或更多次實驗的平均值和標準差。
[0020] 圖8是示出PBS或H64Q神經(jīng)珠蛋白輸注后5分鐘和10分鐘CO-暴露的小鼠的血 液中HbCO濃度衰減百分率的圖。柱子從左至右表示：PBS輸注5分鐘；PBS輸注10分鐘； H64Q Ngb輸注5分鐘；以及H64Q Ngb輸注10分鐘。
[0021 ] 圖9A是顯示H64Q神經(jīng)珠蛋白作為經(jīng)輸注的小鼠的尿中的NgbCO被清除的圖。示 出了來自在CO暴露結(jié)束后約75分鐘時處死的小鼠的膀胱的尿的吸光度。上方的三根跡線 顯示由神經(jīng)珠蛋白導(dǎo)致的吸光度，其包含82 %至91 %的NgbCO。底部的跡線表示不是由Ngb 導(dǎo)致的吸光度。圖9B是H64Q Ngb治療的小鼠的內(nèi)部器官和具有包含NgbCO的紅色尿的注 射器的照片。
[0022] 序列表
[0023] 列于所附序列表中的氨基酸序列是使用根據(jù)37C. F. R. 1. 822定義的氨基酸的標 準三字母代碼來示出。該序列表作為創(chuàng)建于2014年2月20日的9. 98KB的ASCII文本文 檔而提交，其通過引用的方式納入本文。在所附的序列表中：
[0024] SEQ ID NO: 1是人神經(jīng)珠蛋白的氨基酸序列。
[0025] SEQ ID N0:2是包含一個或多個突變的重組人神經(jīng)珠蛋白的氨基酸序列。
[0026] SEQ ID N0:3是包含第46、55、64和120位殘基處的突變的重組人神經(jīng)珠蛋白的氨 基酸序列。
[0027] SEQ ID NO:4是人細胞珠蛋白的氨基酸序列。
[0028] SEQ ID N0:5是包含一個或多個突變的重組人細胞珠蛋白的氨基酸序列。
[0029] SEQ ID N0:6是包含第38、81和83位殘基處的突變的重組人細胞珠蛋白的氨基酸 序列。
【具體實施方式】
[0030] I.縮略詞表
[0031] Cgb細胞珠蛋白
[0032] CO -氧化碳
[0033] Hb血紅蛋白
[0034] HbCO碳氧血紅蛋白
[0035] Ngb神經(jīng)珠蛋白
[0036] NgbCO碳氧神經(jīng)珠蛋白
[0037] RBC紅細胞
[0038] II.術(shù)語和方法
[0039] 除非另有注明，否則根據(jù)常規(guī)用法來使用技術(shù)術(shù)語根據(jù)。分子生物學(xué)中的常 用術(shù)語的定義可在以下文獻中找到：Benjamin Lewin，Genes V，0xford University出 版社出版，1994(ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew et al.(編），The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9);以及 Robert A. Meyers (編），Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers Inc.出版，1995 (ISBN 1-56081-569-8)。
[0040] 為了便于瀏覽本公開內(nèi)容的各實施方案，提供了以下的對特定術(shù)語的解釋：
[0041] 給藥：通過有效的途徑將藥劑例如治療劑（例如，重組多肽）提供或給予受試者。 示例性的給藥途徑包括但不限于，注射或輸注（例如，皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、靜脈 內(nèi)、腦室內(nèi)、紋狀體內(nèi)、顱內(nèi)和脊髓內(nèi)）、口服、管內(nèi)、舌下、直腸、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、陰道和吸入途 徑。
[0042] 解毒劑：中和或抵消毒物作用的試劑。
[0043] 一氧化碳（CO):無色、無臭且無味的氣體，當(dāng)其以足夠高的濃度遭遇時對人和動 物有毒。在正常的動物代謝期間還以低水平產(chǎn)生C0。
[0044] 碳氧血紅蛋白（HbCO):當(dāng)吸入CO或在正常代謝期間產(chǎn)生CO時，在紅細胞中形成 的一氧化碳（CO)與血紅蛋白（Hb)的穩(wěn)定的絡(luò)合物。
[0045] 碳氧血紅蛋白血癥或一氧化碳中毒：因血液中存在過量的一氧化碳而導(dǎo)致的病 癥。通常而言，暴露于百萬分之（ppm) 100或更高的CO足以引起碳氧血紅蛋白血癥。輕度的 急性CO中毒的癥狀包括頭暈、意識錯亂（confusion)、頭痛眩暈和類流感效應(yīng)；更大的暴露 可導(dǎo)致對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟的顯著毒性，以及甚至死