麥芽汁培養(yǎng)基適于僅以中藥材為發(fā)酵基質；當發(fā)酵基質中含有水 果時可以以水果漿液作為培養(yǎng)基；如果發(fā)酵基質中含有谷物類物質時可以以谷物的水溶液 作為培養(yǎng)基。這種原則僅做一般性指導，當發(fā)酵基質中碳水化合物和水含量足夠用于發(fā)酵 菌生長時，則可以使用發(fā)酵基質作為培養(yǎng)基。
[0040] (3)制備發(fā)酵基質：在滅菌培養(yǎng)基中，加入鎖陽原料，優(yōu)選加入研磨成漿液的鎖陽 原料。作為優(yōu)選，所述鎖陽原料的加入量為培養(yǎng)基的〇. 3-8% (w/v，v/v)、或1-5% (w/w，v/ v)、或2.5% (w/w，v/v)。進一步優(yōu)選加入其他中藥材粉末，更進一步優(yōu)選加入谷物、蔬菜、 食用菌、堅果、海底植物等其中的一種或多種。其他中藥材或谷物、蔬菜、食用菌、堅果、海底 植物可以粉末形式依據(jù)常規(guī)用量加入，一般為0-10% (w/v)。
[0041] (4)菌種植入并發(fā)酵：將選擇的菌種進行擴大培養(yǎng)后，植入所述發(fā)酵基質中進行 發(fā)酵。作為優(yōu)選，所述菌種為厭氧菌種、好氧菌種或厭氧與好氧菌種兼用。所述厭氧、好氧 菌種的植入量為發(fā)酵基質5-16% (w/w)，或8-12% (w/w)、或10% (w/w)。作為優(yōu)選，所述 擴大培養(yǎng)包括固體斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)和/或種子罐培養(yǎng)。作為優(yōu)選，所述固體斜面培養(yǎng)的 培養(yǎng)基組成包括葡萄糖2-4%、蛋白胨1-3 %、豆粉1-2 %、瓊脂2-4%、硫酸鎂0. 05-0. 08 %、 磷酸二氫鉀〇. 2-0. 3%、氯化鈉0. 1-0. 3%。作為優(yōu)選，所述搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括葡萄 糖2-3 %，蛋白胨1-4 %，豆粉0. 5-2 %，麩皮0. 5-2 %，硫酸鎂0. 01-0. 1 %，磷酸二氫鉀 0. 1-0. 4%、磷酸氫二鉀0. 1-0. 2%。作為優(yōu)選，所述搖瓶的轉速為200轉/min。作為優(yōu)選， 所述種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基為牛肉膏0.5% -1.5%、蛋白胨1% -2%、玉米漿0.5% -1.0%、 磷酸二氫鉀0.03 % -0.05%、硫酸鋅0.02 % -0.07%、氯化鎂0.04 % -0.08%，其余為水。
[0042]作為優(yōu)選，當選擇厭氧菌種時，在厭氧條件下于25-40°C密封靜置培養(yǎng)15-40天， 或發(fā)酵溫度為28-35°C、30-32°C或31°C，發(fā)酵時間為21-35天、25-28天或27天。
[0043]進一步優(yōu)選，當選擇好氧菌種時，在通氣條件下于22_35°C發(fā)酵7-30天，或發(fā)酵溫 度為25-30°C或28 °C，發(fā)酵時間為14-25天或18-22天或20天。所通氣體為無菌空氣，通 氣量為 2. 5-5.OL/min。
[0044] 更進一步優(yōu)選，所述發(fā)酵分階段進行，第一階段為好氧發(fā)酵，選擇好氧菌種，發(fā)酵 溫度為22-35°C，無菌空氣通氣量為2. 5-5.OL/min，好氧發(fā)酵時間為7-30天；第二階段轉為 厭氧發(fā)酵，選擇厭氧菌種，關閉通氣，控制發(fā)酵溫度為25-40°C，厭氧發(fā)酵時間為15-40天。
[0045] (5)抽取發(fā)酵后的液體，經(jīng)過濾后得到鎖陽酵素。
[0046] 固體發(fā)酵方法：
[0047]將發(fā)酵菌種接種于含有固體培養(yǎng)基的發(fā)酵基質后在一定條件下發(fā)酵。
[0048] 用于本發(fā)明的固體發(fā)酵菌種包括但不限于酵母菌、乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利 亞乳桿菌、植物乳桿菌、芽孢桿菌、雙岐桿菌、米曲霉、蜜環(huán)菌、蟲草菌、靈芝菌、朱紅菌等一 種或多種能夠用于食物或藥物發(fā)酵的菌種。
[0049] 用于本發(fā)明固體發(fā)酵的培養(yǎng)基是用于食物或藥物常見的培養(yǎng)基如包括但不限于 麥芽汁固體培養(yǎng)基、水果培養(yǎng)基、谷物培養(yǎng)基等。所述培養(yǎng)基中可以加入糖類、氮源和無機 鹽。所述糖類包括但不限于白糖、紅糖、低聚糖類、糖醇類、冰糖、蜂蜜等。作為優(yōu)選，所述糖 類的加入量為原料總重量的0-8%。所述氮源包括但不限于酵母粉、蛋白胨、黃豆餅粉、玉米 漿、魚粉、蠶蛹粉、麩皮等。作為優(yōu)選，所述氮源的加入量為原料總重量的0-10%。所述無機 鹽包括但不限于硫酸銨、氯化錳、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等。作為優(yōu)選，所述無機 鹽的加入量為原料總重量的0-3%。優(yōu)選地，在發(fā)酵過程中，根據(jù)菌種的不同分階段植入培 養(yǎng)基。
[0050] 用于本發(fā)明固體發(fā)酵的方法包括如下步驟：
[0051] (1)對原材料進行殺菌處理，此處的殺菌處理包括低溫殺菌、射線殺菌、化學殺菌 等不破壞原材料品質的殺菌處理方法；
[0052] (2)制備培養(yǎng)基：采用本領域常規(guī)方法制備各種液體發(fā)酵培養(yǎng)基，包括但不限于 麥芽汁固體培養(yǎng)基、水果培養(yǎng)基、谷物培養(yǎng)基。
[0053] 作為優(yōu)選，所述麥芽汁固體培養(yǎng)基是將麥芽經(jīng)過篩選、清洗、干燥，制得的干麥芽 經(jīng)糖化、糊化、過濾等工序，最后加入瓊脂制成。作為優(yōu)選，所述麥芽為大麥麥芽或小麥麥 芽。作為優(yōu)選，所述干燥為曬干或烘干。作為優(yōu)選，所述糖化采用酸法、酶法或酸酶結合 法糖化。作為優(yōu)選，所述瓊脂的加入量為1-5% (g/100mL)，或2-4% (g/100mL)、或3% (g/100mL)〇
[0054] 作為優(yōu)選，所述水果培養(yǎng)基是取水果可食用部分，經(jīng)清洗、打漿（加水或不加水）、 過濾、濃縮，最后加入瓊脂制得。作為優(yōu)選，所述濃縮至漿液中固含量為3-15% (g/100mL)、 或5-10% (g/100mL)、或8% (g/100mL)。作為優(yōu)選，所述瓊脂的加入量為1-5% (g/100mL)， 或 2-4% (g/100mL)、或 3% (g/100mL)。
[0055] 作為優(yōu)選，所述谷物培養(yǎng)基是將谷物去雜、清洗、研磨后，加水煮沸、過濾，加入瓊 脂而得。作為優(yōu)選，所述瓊脂的加入量為1-5% (g/100mL)，或2-4% (g/100mL)、或3% (g/100mL)〇
[0056] 作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基在使用前需經(jīng)滅菌處理。
[0057] 作為優(yōu)選，所述麥芽汁固體培養(yǎng)基適于僅以中藥材為發(fā)酵基質；當發(fā)酵基質中含 有水果時可以選擇水果培養(yǎng)基；如果發(fā)酵基質中含有谷物類物質時可以選擇谷物培養(yǎng)基。 這種原則僅做一般性指導，當發(fā)酵基質中碳水化合物和水含量足夠用于發(fā)酵菌生長時，則 可以使用發(fā)酵基質作為培養(yǎng)基。
[0058] (3)制備發(fā)酵基質：在滅菌培養(yǎng)基中，加入鎖陽原料，優(yōu)選加入切成適宜大小的片 狀、條狀或粒狀的鎖陽原料。作為優(yōu)選，所述鎖陽原料的加入量為培養(yǎng)基的0.3-8% (w/w)、 或1-5% (w/w)、或2.5% (w/w)。進一步優(yōu)選加入其他中藥材粉末，更進一步優(yōu)選加入谷 物、蔬菜、食用菌、堅果、海底植物等其中的一種或多種。其他中藥材或谷物、蔬菜、食用菌、 堅果、海底植物可以粉末形式依據(jù)常規(guī)用量加入，一般為0-10% (w/w)。
[0059] (4)菌種植入并發(fā)酵：將選擇的菌種進行擴大培養(yǎng)后，植入所述發(fā)酵基質中進行 發(fā)酵。作為優(yōu)選，所述菌種為厭氧菌種、好氧菌種或厭氧與好氧菌種兼用。所述厭氧、好氧 菌種的植入量為發(fā)酵基質5-16 % (w/w)，或8-12 % (w/w)、或10 % (w/w)。作為優(yōu)選，所述 擴大培養(yǎng)包括固體斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)和/或種子罐培養(yǎng)。作為優(yōu)選，所述固體斜面培養(yǎng)的 培養(yǎng)基組成包括葡萄糖2-4%、蛋白胨1-3 %、豆粉1-2 %、瓊脂2-4%、硫酸鎂0. 05-0. 08 %、 磷酸二氫鉀〇. 2-0. 3%、氯化鈉0. 1-0. 3%。作為優(yōu)選，所述搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括葡萄 糖2-3 %，蛋白胨1-4 %，豆粉0. 5-2 %，麩皮0. 5-2 %，硫酸鎂0. 01-0. 1 %，磷酸二氫鉀 0. 1-0. 4%、磷酸氫二鉀0. 1-0. 2%。作為優(yōu)選，所述搖瓶的轉速為200轉/min。作為優(yōu)選， 所述種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基為牛肉膏0.5% -1.5%、蛋白胨1% -2%、玉米漿0.5% -1.0%、 磷酸二氫鉀0.03 % -0.05%、硫酸鋅0.02 % -0.07%、氯化鎂0.04 % -0.08%，其余為水。
[0060] 作為優(yōu)選，當選擇厭氧菌種時，在厭氧條件下于25-40°C密封靜置培養(yǎng)15-40天， 或發(fā)酵溫度為28-35 °C、30-32°C或31°C，發(fā)酵時間為21-35天、25-28天或27天。
[0061] 進一步優(yōu)選，當選擇好氧菌種時，在通氣條件下于22-35°C發(fā)酵7-30天，或發(fā)酵溫 度為25-30°C或28 °C，發(fā)酵時間為14-25天或18-22天或20天。所通氣體為無菌空氣，通 氣量為 2. 5-5.OL/min。
[0062] 更進一步優(yōu)選，所述發(fā)酵分階段進行，第一階段為好氧發(fā)酵，選擇好氧菌種，發(fā)酵 溫度為22-35°C，無菌空氣通氣量為2. 5-5.OL/min，好氧發(fā)酵時間為7-30天；第二階段轉為 厭氧發(fā)酵，選擇厭氧菌種，關閉通氣，控制發(fā)酵溫度為25-40°C，厭氧發(fā)酵時間為15-40天。
[0063] (5)收集培養(yǎng)基，獲得本發(fā)明鎖陽酵素。
[0064]肉蓯蓉酵素的制備：
[0065]用于本發(fā)明的肉蓯蓉酵素是以肉蓯蓉為核心基質，通過現(xiàn)代生物發(fā)酵技術而制 得。
[0066]用于制備本發(fā)明肉蓯蓉酵素的原料主要是肉蓯蓉，進一步可含有谷物、蔬菜、水 果、堅果、食用菌、草本（其他中藥材）以及海底植物等。
[0067]用于本發(fā)明肉蓯蓉酵素的肉蓯蓉是指新鮮的肉蓯蓉、干燥的肉蓯蓉或經(jīng)過各種炮 制方法炮制的肉蓯蓉飲片，所述肉蓯蓉選自肉蓯蓉、管花肉蓯蓉、鹽生肉蓯蓉、沙蓯蓉和/ 或草蓯蓉。其中新鮮的肉蓯蓉在凈選后切成適宜大小的片狀、條狀或粒狀用于發(fā)酵處理，或 打磨成漿液用于發(fā)酵處理。對于干燥肉蓯蓉或肉蓯蓉飲片可經(jīng)浸泡后制備成適宜大小的片 狀、條狀或粒狀用于發(fā)酵處理，或打磨成漿液用于發(fā)酵處理，或不經(jīng)浸泡直接磨成粉末進行 發(fā)酵處理。
[0068] 用于本發(fā)明的所述谷物包含但不限于小麥、大米、玉米、小米、豆類；所述蔬菜包含 但不限于葉類、根莖類、果實類，如黃瓜、香瓜、西瓜、苦瓜、野菜、椰菜、蘿卜、白菜、豆芽、萵 苣、芹菜等；所述水果包含但不限于橘子、番茄、檸檬、葡萄、各類梨、蘋果、木瓜、楊桃、草莓 等。所述堅果包含但不限于核桃、花生、榛子、松籽等。所述食用菌包含但不限于各類蘑菇。 所述草本包含但不限于枸杞、人參、蘆薈、冬蟲夏草、靈芝等。所述海底植物包含但不限于海 帶、紫菜等。上述材料以漿液或粉末的形式使用。
[0069] 用于本發(fā)明的發(fā)酵方式有液體發(fā)酵方法和固體發(fā)酵方法。
[0070] 液體發(fā)酵方法：
[0071] 將發(fā)酵菌種接種于含有液體培養(yǎng)基的發(fā)酵基質后在一定條件下發(fā)酵。
[0072] 用于本發(fā)明的液體發(fā)酵菌種包括但不限于酵母菌、乳酸菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞 乳桿菌、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、雙岐桿菌、米曲霉、蜜環(huán)菌、蟲草菌、靈芝菌、朱紅菌等 一種或多種能夠用于食物或藥